G-CSF对于血管性痴呆大鼠保护作用的研究

杨 静，王 维，沈恩旭，马兴丽，王朋明

(天津市西青医院，天津300380)

血管性痴呆(VD)是痴呆中最为常见的类型之一，血管性痴呆是一种隐匿发病的、逐渐进展的记忆及认知障碍的疾病，仅仅次于阿尔兹海默病(AD)。血管性痴呆是由于慢性脑供血不足所致，当大脑血流及营养的供应被阻断数分钟，脑细胞就会出现坏死，从而导致脑皮层的损伤，继而引起学习、记忆及语言的障碍。根据个人情况不同，以及中风的严重程度的不同，血管性痴呆可以逐渐发生，也可以突然发生。

到目前为止还没有FDA批准的用于治疗血管性痴呆的药物。对于血管性痴呆的神经干细胞治疗受到高度关注。干细胞的研究是一个快速发展的领域。因为干细胞可以分化为神经元从而修复脑损伤［1］。本文采用集落细胞刺激因子(G-CSF)治疗VD模型大鼠，研究其对VD大鼠认知功能的影响。

1 材料与方法

1.1 实验大鼠:本实验用成年雄性健康Wistar大鼠。体重200～250 g，购于军事医学科学院实验动物中心。

1.2 实验分组:将20只Wistar只大鼠随机分为两组，双侧颈总动脉永久结扎(VD)组，VD集落细胞刺激因子治疗组(VD+GSF)，每组10只大鼠。

1.3 VD大鼠模型制作:采用持久性双侧颈总动脉结扎法(2VO)建立血管性痴呆的老年大鼠模型。10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，颈部皮肤剃毛备皮，碘伏消毒后沿颈部中线切开约1.5 cm的皮肤切口，找到并游离双侧颈总动脉，同时结扎。70%酒精消毒后缝合伤口，大鼠放回笼中饲养。

1.4 药物给予:VD治疗组给予G-CSF干预，具体过程为术后2 h给予G-CSF 200 ug/kg皮下注射，之后每d 1次，共5 d。

1.5 Morris水迷宫(MWM)测试。

1.6 抗Nestin免疫组织化学染色:兔抗大鼠一抗(抗nestin抗体，1∶100)、二抗均购于武汉博士德。

1.7 统计学分析:三组间比较采用SPSS 16.0软件，单因素方差分析及选择多重比较分析。有统计学意义设在P＜0.05。

2 结果

2.1 VD模型大鼠认知功能的改善:Morris水迷宫实验中，VD模型大鼠给予集落细胞刺激因子治疗后，与模型组大鼠相比，VD治疗组大鼠的逃避潜伏期明显缩短(P＜0.05，图1)，而游泳速度并没有改变(P＞0.05)。在第六天的测试阶段，VD治疗组大鼠的目标象限百分比明显高于VD模型组大鼠(P＜0.05，图2)。而游泳速度在两组组间并无明显差异(P＞0.05)。

图1 Morris水迷宫定位巡航实验

VD治疗组大鼠的逃避潜伏期明显低于VD模型组大鼠，两组比较具有统计学意义(P＜0.05)。

VD治疗组大鼠的目标象限百分比较VD模型组大鼠增加，两组比较具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 Nestin免疫组织化学染色:我们使用Nestin抗体观察了大鼠海马齿状回区Nestin的表达情况。两组大鼠的齿状回区的颗粒细胞都有Nestin阳性表达，分布于胞体中。VD治疗组大鼠Nestin阳性表达多余VD大鼠的阳性表达。

图2 Morris水迷宫空间搜索实验

3 讨论

水迷宫实验表明，三组大鼠无论在定位航行阶段还是在空间探索阶段游泳速度都没有显著性差异，因此可以得出用该方法建立的VD动物模型，没有明显的运动障碍，有利于长时间观察和研究。不论在学习阶段还是在记忆维持阶段，Morris水迷宫实验证实，大鼠的学习记忆能力有明显下降。血管性痴呆是由于慢性脑供血不足所致，常常由中风或者腔隙性梗塞所致［2］。血管性痴呆是一种隐匿发病的，逐渐进展的记忆及认知障碍的疾病。根据个人情况不同，以及中风的严重程度的不同，血管性痴呆可以逐渐发生，也可以突然发生。对于血管性痴呆的治疗以预防为主，以及扩血管，血管内膜旋切等改善血管供血的对症治疗。到目前为止还没有确切的用于治疗血管性痴呆的药物。

粒集落细胞刺激因子(G-CSF)是一种造血生长因子，是一种分子量为19.6 kDa的糖蛋白，G-CSF和其受体在中枢神经系统都有表达，在中风的动物模型中表现出神经保护作用。目前被认为是一种有希望的治疗急性中风的药物。VD常常由中风或者腔隙性梗塞所致，因此本研究观察了其对于VD的保护作用。研究表明，VD大鼠和假手术组大鼠相比，认知功能下降，当给予集落细胞刺激因子治疗后，与未给予治疗的VD组大鼠相比，认知功能得到明显改善。这说明粒集落细胞刺激因子参与了损伤脑组织的修复过程或替代了坏死神经细胞的功能。

对于血管性痴呆的神经干细胞治疗受到高度关注。G-CSF的神经保护作用与其促进成人神经干细胞向神经元的分化有关［3］。对于干细胞的研究是一个快速发展的领域。因为干细胞可以分化为神经元从而修复脑损伤。因而改善脑功能提高认知水平在成年大鼠的脑区有三个部位干细胞存在，即脑室周围、嗅球以及海马齿状回［4］。本研究观察了给予集落细胞刺激因子治疗VD后的Nestin的表达情况。我们的实验结果标明在VD治疗组大鼠的齿状回区Nestin的表达多于VD模型组大鼠。Nestin是一种中间丝蛋白，是未分化的神经干细胞的标志［5］，Nestin的高表达标明集落细胞刺激因子可能通过增加神经干细胞的动员，分化为神经元从而发挥损伤脑组织的修复过程或替代了坏死神经细胞的功能。

集落细胞刺激因子是一种临床使用安全的药物，本实验中表现出神经保护作用，并且可能与干细胞的动员有关，本研究为其临床使用提供了良好的实验依据。

［1］ Kalladka D，Muir KW.Stem cell therapy in stroke:Designing clinical trials.Neurochem Int，2011.

［2］ Sharp SI，Aarsland D，Day S，et al.Hypertension is a potential risk factor for vascular dementia:systematic review［J］.Int J Geriatr Psychiatry，2011，26(7):661-669.

［3］ Schneider A，Kuhn HG，Schabitz WR.A role for G-CSF(granulocyte-colony stimulating factor)in the central nervous system［J］.Cell Cycle，2005，4(12):1753-1757.

［4］ Scharfman HE，Hen R.Neuroscience.Is moreneurogenesis always better?Science，2007，315(5810):336-338.

［5］ Wurdak H，Zhu S，Min KH，et al.A small molecule accelerates neuronal differentiation in the adult rat［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(38):16542-16547.