长期投喂黄芪多糖对黄颡鱼免疫细胞活性的影响

吴 旋 白东清 朱国霞 宁 博

随着水产动物养殖规模地不断扩大,水产品产量逐年上涨,人们对水产品品质提出了更高的要求[1]。但是水产动物疾病频发,是制约水产品品质提高的瓶颈。因此,寻求一种高效、环保、低毒副作用的药物,已成为水产养殖领域的热点问题。而中草药多糖在此方面发挥了独到的功效,为解决该难题做出了巨大的贡献。

黄芪多糖(Astraglus polysaccharides,APS)是从黄芪中提取的天然活性成分[2],具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、调节机体体液免疫、激活免疫细胞因子等功效,目前黄芪多糖作为免疫增强剂在水产养殖中已见报道[3-7],但其在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)上的研究及应用尚未见报道。基于此,本研究以我国的淡水经济鱼类——黄颡鱼作为试验对象,在鱼饲料中分别添加不同水平的黄芪多糖,旨在探讨长期连续投喂黄芪多糖对黄颡鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发活性与外周血白细胞增殖能力的影响,为寻求提高黄颡鱼非特异性免疫力的药物开辟新的途径。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验鱼与试验设计

540尾 2龄健康黄颡鱼取自天津农学院渔场,体重(61.6 ±5.4)g、体长(19.5±3.2)cm,随机分成 6组,每组 3个重复,每个重复 30尾鱼。分别投喂添加 0、300、600、900、1 200、1 500 mg/kg黄芪多糖的饲料,饲养期为 8周。试验鱼饲养于架设在养殖池中的 1.5 m×1.5 m×1 m的 18个网箱中,每箱随机投放黄颡鱼 30尾(雌雄各占 1/2)。试验期间水温保持在(26±2)℃,每天连续充氧,试验期间每天换水 1/3左右。日投饵率为 2%,每天投喂 3次。基础饲料组成及营养水平见表 1。

1.1.2 试剂

L-15培养基、脂多糖 (lipopolysaccharide,LPS)、Hanks溶液、佛波豆寇乙酸脂(phobolmyr-istate acetate,PMA)、硝基蓝四氮唑(nitroblue tetrazolium,NBT)、肝素钠、超氧化物歧化酶标准品和噻唑兰(thiazolyl blue,MTT)购自 Sigma公司;胎牛血清购自 Gibco公司;链霉素 -青霉素购自北京鼎国生物技术有限责任公司。硅石 -聚乙烯吡咯烷酮(phytohaemagglutinin,Percoll)、细胞培养板购自 Pharmacia公司;格里斯氏(Griesse)试剂购于上海碧云天生物技术有限公司。

表1 基础饲料组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 方法

1.2.1 黄颡鱼头肾巨噬细胞与外周血白细胞的分离

每组取 6尾鱼,使用 MS-222麻醉后,采用Bayne[8]的方法分离黄颡鱼头肾巨噬细胞,使用Percoll密度梯度法[9]分离头肾巨噬细胞,并使用台盼蓝进行细胞活性检测并计数,以确保活细胞的数量大于 90%,调整细胞密度为 1.0×107个/mL,27℃培养备用。在无菌的条件下进行尾静脉采血,外周血白细胞的分离方法与头肾巨噬细胞的相同。

1.2.2 免疫细胞活性指标检测

头肾巨噬细胞氧呼吸爆发(oxygen respiratory burst,ORB)活性的测定采用 NBT法[10]。以添加0 APS组采集的细胞液为空白对照,在细胞液中添加 LPS(500μg/mL)为阳性对照,其他各 APS组采集的细胞液分别为 1个处理,每个处理设 7个重复。使用酶联免疫检测仪,在 620 nm下,测定吸光度(OD)值。

头肾巨噬细胞氮呼吸爆发(nitrogen respiratory burst,NRB)活性的测定采用 Griesse试剂法[11],其他操作同氧呼吸爆发活力的测定。在 540 nm下测定 OD值。

外周血白细胞的增殖采用 MTT比色法检测[12],每个处理细胞设 12个重复,培养 24 h后,在 570 nm的波长下测定 OD值,记录结果。

1.2.3 数据处理

试验数据用平均值 ±标准误表示,采用 SPSS 17.0软件包中的单因素方差分析(one-way ANOVA),以 P＜0.01和 P＜0.05为显著性标准。

2 结 果

2.1 黄芪多糖对黄颡鱼头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活性的影响

由图 1和表 2可知,与空白对照相比,阳性对照头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活性极显著提高(P＜0.01),这说明试验中培养的细胞状态良好;除300 mg/kg黄芪多糖组头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活性低于空白对照外,其余各组黄颡鱼氧呼吸爆发活性随黄芪多糖添加水平的增加而增加,但仅在1 200 mg/kg组氧呼吸爆发活性显著高于空白对照(P＜0.05)。由此得出,黄芪多糖的添加水平可显著影响头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活性,且1 200 mg/kg黄芪多糖添加水平最适宜。

2.2 黄芪多糖对黄颡鱼头肾巨噬细胞氮呼吸爆发活性的影响

由图 2和表 2可知,与巨噬细胞氧呼吸爆发活性相似,与空白对照相比,阳性对照氮呼吸爆发活性极显著提高(P＜0.01);添加黄芪多糖后,变化趋势也与氮呼吸爆发活性变化相似,并在 1 200和1 500 mg/kg组氮呼吸爆发活性极显著高于空白对照(P＜0.01),但 2组间差异不显著 (P＞0.05)。因此从提高黄颡鱼头肾巨噬细胞氮呼吸爆发活性的角度考虑,饲料中黄芪多糖的适宜添加量为 1 200 mg/kg。

图1 黄芪多糖对黄颡鱼头肾巨噬细胞氧呼吸爆发活性的影响Fig.1 Effects of Astragalus polysaccharides on oxygen respiratory burst activity of head-kidney macrophages of yellow catfish

图2 黄芪多糖对黄颡鱼头肾巨噬细胞氮呼吸爆发活性的影响Fig.2 Effects of Astragalus polysaccharides on nitrogen respiratory burst activity of head-kidney macrophages of yellow catfish

2.3 黄芪多糖对黄颡鱼外周血白细胞增殖的影响

由图 3和表 2可知,各水平黄芪多糖组均能有效地提高黄颡鱼外周血白细胞的增殖能力(P＜0.05),且 1 200和 1 500 mg/kg组外周血白细胞增殖能力比空白对照分别提高了 39.98%与35.97%(P＜0.01),其中 1200 mg/kg水平组增殖效果最好。因此从外周血白细胞增殖能力提高的角度上分析,选择 1 200 mg/kg黄芪多糖水平较适宜。

表2 黄芪多糖对黄颡鱼头肾巨噬细胞呼吸爆发活力及外周血白细胞增值能力的影响Table 2 Effects of Astragalus polysaccharides on respiratory burst activity of head-kidney macrophages and proliferation of peripheral blood leukocyte of yellow catfish

图3 黄芪多糖对黄颡鱼外周血白细胞增殖能力的影响Fig.3 Effects of Astragalus polysaccharides on proliferation of peripheral blood leukocytes of yellow catfish

3 讨 论

3.1 黄芪多糖对动物细胞呼吸爆发活性的影响

在黄芪多糖提高动物机体免疫功能方面,国内外学者已进行了大量研究。Yina等[3]和 Yin等[4]发现,对鲤鱼投喂含 0.5%的黄芪多糖饲料,在第 2、5周时能显著提高头肾巨噬细胞的氧呼吸爆发活性,而黄芪多糖与脂多糖混合后对鲤鱼头肾巨噬细胞进行体外培养,能显著地提高头肾巨噬细胞的氮呼吸爆发活性;László等[5]曾报道,使用含 0.1%黄芪多糖提取物的饲料投喂尼罗罗非鱼,并对其中性粒细胞的氧呼吸爆发活性进行检测,结果显示1～4周黄芪多糖组的呼吸爆发活性均高于对照组;曹丽萍等[6]使用黄芪多糖对鲤鱼巨噬细胞进行体外培养,发现黄芪多糖能显著提高其氮呼吸爆发活性;Lee等[13]研究发现,黄芪多糖能增强巨噬细胞的一氧化氮的产量,并能增强一氧化氮合酶的表达;邱妍等[14]使用黄芪多糖对鸡脾淋巴细胞进行体外培养发现,多糖浓度在100μg/mL时,对其一氧化氮含量的增加具有较好的促进作用,而且存在量效关系。

本试验结果表明,黄芪多糖添加在饲料中投喂黄颡鱼,在适宜的添加范围内能够有效地提高该鱼头肾巨噬细胞的呼吸爆发活性,表明饲料中添加适宜水平黄芪多糖可以有效提高鱼机体免疫细胞的活性,增强机体免疫力。而这一结果恰好与上述的研究结论相印证。

3.2 黄芪多糖对动物白细胞增殖活性的影响

在鱼类的自身免疫系统中巨噬细胞、淋巴细胞与各种粒细胞起着抵抗和杀灭病原菌,保护机体的重要作用。因此白细胞的增殖能力也成为考量一种免疫增强剂是否有效的重要指标。关于黄芪多糖可以提高白细胞的增殖能力已经得到了广泛的证实:曹丽萍等[6]研究发现,黄芪多糖能显著增强鲤鱼外周血白细胞的增殖能力;黄玉章等[7]使用不同添加量的黄芪多糖饲料投喂罗非鱼,结果发现与对照组相比,各试验组罗非鱼肠道上皮内淋巴细胞数量均高于对照组;章世元等[15]等使用黄芪多糖与苜蓿多糖对肉仔鸡的外周血淋巴与脾脏淋巴细胞进行培养,得出结论黄芪多糖具有促进淋巴细胞增殖的作用,在添加量为100μg/mL时效果最佳;王国秀等[16]通过试验得出,黄芪多糖本身或协同刀豆蛋白 A(ConA)或 LPS均能增强小鼠脾淋巴细胞的增殖能力;张训海等[17]指出,黄芪多糖能促进鸡脾淋巴细胞的增殖,且浓度为300 mg/L时效果最佳。这些研究成果均与本试验中得出的黄芪多糖能显著提高黄颡鱼外周血白细胞的增殖,且与添加水平有关的结论相一致。

4 结 论

①连续 8周投喂适宜水平的黄芪多糖能有效地促进黄颡鱼头肾巨噬细胞的氧、氮呼吸爆发活性与外周血白细胞的增殖能力。

②黄芪多糖的添加量在 1 200 mg/kg时的作用效果最佳。

[1] 许宝红,肖调义,陈清华.水产动物健康养殖现状和发展建议[J].内陆水产,2005,(1):36-38.

[2] 姚秀娟,王米,江善祥,等.黄芪多糖药理作用及在动物生产中的应用研究进展[J].饲料工业,2009,30(18):1-3.

[3] YINA G,ARDÓB L,THOMPSONC K D,et al.Chinese herbs(Astragalus radix and Ganoderma lucidum)enhance immune response of carp,Cyprinus carpio,and protection against Aeromonas hydrophila[J].Fish＆Shellfish Immunology,2009,26(1):140-145.

[4] YIN G J,GEERT W,LI Y M,et al.Effect of Astragalus radixon proliferation and nitric oxide production of head kidney macrophages in Cyprinus carpio:an in vitro study[J].Journal of Fisheries of China,2004,6(28):628-634.

[5] LÁSZLÓA,YIN G J,XU P,et al.Chinese herbs(Astragalus membranaceus and Lonicera japonica)and boronenhance the non-specific immune response of Nile tilapia(Oreochromis niloticus)and resistance against Aeromonas hydrophila[J].Aquaculture,2008,275:26-33.

[6] 曹丽萍,丁炜东,张柳,等.2种多糖对鲤鱼离体培养免疫细胞活性的影响[J].安徽农业大学学报,2008,35(2):219-222.

[7] 黄玉章,林旋,王全溪,等.黄芪多糖对罗非鱼肠绒毛形态结构及肠道免疫细胞的影响[J].动物营养学报,2010,22(1):108-116.

[8] BAYNE C J.Pronephric leucocytes of Cyprinus carpio:isolation,separation and characterization[J].Veterinary Immunology and Immunopathology,1986,12:141-151.

[9] SHIM K J,JUNG K H,CHUNG M K,et al.Development of an in vitro environmental monitoring system by using immune cells[J].Journal of Health Science,2002,48(2):131-133.

[10] SECOMBESC J.Isolation of salmonid macrophages and analysis of their killing activity[C]//STOLEN J S,FLETCHER T C,ANDERSON D P,et al.Techniques in fish immunologyⅢ.Fair Haven:SOS Publications,1990:138-154.

[11] GREEN L C,WAGNER D A,GLOGOWSKI J,et al.Analysis of nitrate,nitrite,and[15N]nitratein biological fluids[J].Analytical Biochemistry,1982,126:131-138.

[12] MOSMANN T.Rapid colorimetic assay for celluar grow than survival:application to proliferation and cytotoxicity assay[J].Journal of Immunological Methods,1983,65:55-63.

[13] LEE Y S,HAN O K,PARK C W,et al.Pro-inflammatory gene expression andnitric oxide regulation of aqueous extracted Astragali radixin RAW 264.7 macrophage cells[J].Journal of Ethnopharmacology,2005,100:289-294.

[14] 邱妍,崔保安,董发明,等.4种多糖对鸡脾脏淋巴细胞增殖和一氧化氮分泌的影响[J].畜牧与兽医,2008,40(8):58-60.

[15] 章世元,徐春燕,董晓芳,等.苜蓿多糖和黄芪多糖对肉仔鸡淋巴细胞增殖的影响[J].动物营养学报,2010,22(3):670-674.

[16] 王国秀,蔺威鸣,赵瑞芳,等.6种多糖对小鼠免疫细胞活性作用的比较研究[J].卫生研究,2008,37(5):577-580.

[17] 张训海,王德云,胡元亮,等.黄芪多糖对鸡体液免疫增强作用[J].中国兽医学报,2009,29(3):312-314.