N-乙酰半胱氨酸对脂多糖刺激仔猪空肠黏膜抗氧化能力的影响

张 伟 杨震国 侯永清 丁斌鹰 朱惠玲 刘玉兰 王 蕾

肠黏膜是机体抵御病原菌和毒素的天然屏障,在细菌、病毒或内毒素等应激状态下,机体对能量的需求大量增长,导致大量自由基产生,自由基使核酸和蛋白质氧化,并通过脂质过氧化反应损伤生物膜,破坏了肠黏膜的完整性及功能[1-2]。因此,通过营养调控途径改善动物肠道黏膜的抗氧化能力、提高生产性能变得意义巨大。现已证实谷胱甘肽(GSH)在机体生物抗氧化体系中发挥重要作用,它通过清除自由基维持细胞正常的结构和功能,保护组织免受氧化损伤,但外源性 GSH不能进入完整细胞内,它的胞内合成需要外源供给 GSH的前体物质[3]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)为硫醇类化合物,是天然氨基酸 L-半胱氨酸与 GSH的前体[4],NAC作为小分子物质,易于进入细胞,脱乙酰基后成为 GSH合成的前体,促进 GSH的合成。体内试验发现 NAC能提高小鼠红细胞、肝组织和肺组织中细胞内的GSH水平[5],增强组织的抗自由基能力。另外,NAC作为 L-半胱氨酸的乙酰化合物,其含有活跃的—SH,具有干扰自由基生成,调节细胞代谢等活性作用,在呼吸、心血管和神经系统方面的疾病及艾滋病的临床和试验研究中均有广泛应用[6]。NAC对猪的抗氧化作用仍鲜有报道。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分之一,进入体内可导致大量自由基产生[7],常作为模拟应激的经典模型。由此,本试验旨在通过对仔猪多次腹膜注射 LPS建立慢性免疫应激模型,研究 NAC对猪空肠黏膜抗氧化能力的影响,探讨 NAC缓解 LPS应激导致生长抑制的机理,为 NAC的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

NAC:市售医药级产品,纯度≥99.0%。LPS:大肠杆菌血清型 055∶B5,SIGMA公司产品。

1.2 试验动物与试验设计

选取 18头健康的(35±2)日龄仔猪[杜洛克 ×长白 ×大白,平均体重(11.58±0.26)kg],随机分成 3个组(对照组、LPS组、NAC组 ),每组6个重复,每个重复 1头猪。预试期 3 d,正试期20 d。对照组和 LPS组饲喂基础饲粮,NAC组饲喂基础饲粮 +0.05%NAC,在试验第 10天、第 13天和第 20天清晨,LPS组和 NAC组仔猪按100μg/kg BW的量腹膜注射 LPS,对照组注射相应剂量的灭菌生理盐水。第 21天清晨,即最后1次注射 LPS 24 h后,全部仔猪注射戊巴比妥钠(50 mg/kg BW),待完全麻醉后屠宰,取空肠黏膜,待测。

1.3 饲粮组成与饲养管理

试验基础饲粮为玉米 -豆粕型饲粮,参照NRC(1998)10～20 kg猪的营养需要配制,其组成及营养水平见表 1。

试验期间猪舍保持温度为 22～25℃。试验猪在不锈钢代谢笼中单体饲养,鸭嘴式饮水器自动供水,自由采食,定时清扫和消毒猪舍。

1.4 样品采集

猪屠宰后剖开腹腔,于空肠 1/2处截取长约10 cm的肠段,用冰冻的生理盐水清洗后,在冰盘上用玻片迅速刮取黏膜,然后转至盛有液氮的研钵中研成粉末,分装。迅速转移至 -80℃冰箱冻存。

1.5 测定指标与方法

空肠黏膜氧化相关酶活性测定,包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、一氧化氮合酶(NOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS);空肠黏膜氧化相关产物的含量测定,包括丙二醛(MDA)、过氧化氢(H2O2)、超氧阴离子(O-2)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原型谷胱甘肽(GSH)。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet(air-dry basis) %

其中,O2-含量参考谭亚男等[8]的方法,其他指标均采用试剂盒测定。GSSG和 GSH试剂盒购买于碧云天生物技术研究所,其含量采用二硫代二硝基苯甲酸法测定,步骤详见试剂盒说明书。其余试剂盒购买于南京建成生物工程研究所,SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法测定,CAT活性采用紫外分光法测定,GSH-Px活性采用二硫代二硝基苯甲酸法测定,NOS和 iNOS活性采用 NOS催化 L-Arg比色法测定,MDA含量采用硫代巴比妥酸(TAB)法测定,H2O2含量采用钼酸络合物比色法测定,具体步骤参照试剂盒说明书。

1.6 数据分析

试验数据采用 SPSS 13.0统计软件中的单因素方差分析(One-way ANOVA)和 Duncan氏法多重比较,以 P＜0.05为差异显著性标准,结果用平均值 ±标准差表示。

2 结 果

2.1 空肠黏膜氧化相关酶活性

由表 2可知,与对照组相比,LPS组的 SOD和CAT活性分别降低了 16.03%(P＜0.01)和47.52%(P＜0.01),NOS和 iNOS活性分别提高了21.95%(P＜0.05)和 30.00%(P＜0.01);与 LPS组相比,NAC组的 CAT活性提高了 35.61%(P＜0.05),iNOS活性降低了 18.68%(P＜0.01);与对照组相比,NAC组的 CAT活性降低了 28.83%(P＜0.01),其他指标差异不显著 (P＞0.05)。GSH-Px活性各组差异不显著(P＞0.05)。

2.2 空肠黏膜氧化相关产物的含量

由表 3可知,与对照组相比,LPS组的 MDA、H2O2、O-2含量和 GSSG/GSH分别提高了 27.81%(P＜0.05)、15.36%(P＜0.05)、89.15%(P＜0.01)和 130.69%(P＜0.01);与 LPS组相比,NAC组的 MDA、H2O2、O-2含量和 GSSG/GSH分别降低了 24.06%(P＜0.05)、11.75(P＜0.05)、32.34%(P＜0.01)和 54.08%(P＜0.01);与对照组相比,NAC组的 O-2含量升高了 27.98%(P＜0.01),其他指标差异不显著(P＞0.05)。

表2 饲粮添加NAC对 LPS刺激仔猪空肠黏膜氧化相关酶的影响Table 2 Effects of dietary NAC on oxidation-relevant enzymes in jejunal mucosa of LPS-challenged piglets

表3 饲粮添加 NAC对LPS刺激仔猪空肠黏膜氧化相关产物的影响Table 3 Effects of dietary NAC on oxidation-relevant products in jejunal mucosa of LPS-challenged piglets

3 讨 论

3.1 NAC对LPS刺激仔猪空肠黏膜氧化相关酶的影响

本试验中,LPS刺激导致仔猪空肠黏膜 SOD和CAT活性的降低,说明 LPS多次刺激导致空肠黏膜SOD和 CAT被大量消耗,空肠黏膜抗氧化酶系统受到损害,而在 LPS刺激仔猪饲粮中添加 NAC后,SOD和 CAT活性升高,说明 NAC有助于维持抗氧化酶系统的平衡,缓解 LPS应激导致的氧化应激。作者推测 NAC可能通过抑制 NADPH氧化酶活性,导致质膜 NADPH氧化酶从 NAD(P)H传递电子给O2的能力降低,使得 O-2生成受阻,减少了抗氧化酶 SOD和 CAT的消耗,从而缓解了 LPS导致的氧化应激。Sridharan等[12]研究发现,NAC连续 1周胃内预处理给药,可以增加大鼠体内 SOD、CAT的活性,与本试验结果类似。

一氧化氮(NO)作为一种信使或介质,它既有利于机体的自身免疫防御能力,又具有潜在的毒性,而 NO的作用和信使功能主要受 NOS调控[13]。NOS分为固有型(cNOS)和诱导型(iNOS),iNOS在肠黏膜中含量丰富,在缺氧或内毒素刺激后迅速被活化[14]。肠黏膜受到应激后 iNOS由非激活状态迅速活化,产生大量的 NO,高浓度的 NO容易与体内 O-2形成氧化性更强的 ONOO-,后者可诱导脂质过氧化损伤[15]。

本试验中,LPS刺激使空肠黏膜 NOS和 iNOS活性升高,添加 NAC后 iNOS活性显著降低。这证实 LPS刺激可以促进 NOS和 iNOS的活化,进而可能引起 NO大量生成,对肠黏膜组织产生毒害作用,导致氧化损伤。NAC对肠黏膜氧化损伤的缓解作用可能由于 NAC抑制了 LPS刺激诱导的 iNOS表达,具体机理有待进一步研究。与此类似,巫国谊等[16]也研究发现,NAC能降低肝脏 iNOS活性,改善急性肝损伤。

3.2 NAC对 LPS刺激仔猪空肠黏膜氧化相关产物的影响

MDA是脂质过氧化反应的一种重要分解产物,可以间接反映机体组织氧化损伤的程度[17]。而自由基主要有 O-2自由基、羟自由基、H2O2等,这些自由基是机体氧化反应中产生的有害化合物,具有强氧化性,它们的含量高低反映了组织自由基的积累程度[18]。GSSG是 GSH的氧化形式,在氧化剂作用下 GSH通过 GSH-Px氧化成 GSSG,而 GSSG通过 NADPH供氢,在谷胱甘肽还原酶的作用下又还原成 GSH,二者构成一个动态平衡,使 GSSG维持在总 GSH量的 1%～10%[19],构成有效的抗氧化系统,故可用来评估脂质过氧化损伤情况[20]。

本试验研究发现,LPS多次刺激导致仔猪空肠黏膜 MDA、H2O2、O-2含量增多,GSSG/GSH上升,饲粮中添加 NAC后均降低,表明 LPS刺激使肠黏膜自由基或氧化产物增多,导致脂质过氧化,而NAC能降低自由基等有害产物的积累,调节氧化与还原产物的比率,抑制 LPS对肠黏膜的损害。NAC的作用可能是因为 NAC为细胞内提供—SH来源,而活性—SH具有较强的还原能力,对体内自由基具有明显的拮抗作用;另外,NAC能将细胞外的胱氨酸还原为半胱氨酸,并可在肠黏膜细胞中转化成GSH,进而通过 GSH发挥抗氧化作用,清除体内的自由基。田新强等[21]发现,LPS导致小鼠肝脏 GSH含量显著降低,MDA含量显著升高,而饲粮中添加NAC能显著改善这种情况;刘平洋[22]研究发现饲粮中添加 GSH可显著降低小肠黏膜 MDA含量,改善仔猪肠道的脂质过氧化损伤;乔小蓉等[23]在人血清中加入 NAC表明,GSH/GSSG显著升高。这些都与本试验结果类似。

抗氧化酶与氧化相关产物之间存在着紧密的联系,如 SOD能促进 O-2分解成 O2和 H2O2,而 H2O2又能在 GSH-Px和 CAT的作用下分解成无毒害的H2O和 O2。GSSG和 GSH能在 GSH-Px的调解下相互转化,它们之间存在典型的氧化/抗氧化的动态平衡,这可能是饲粮中添加 NAC同时影响氧化相关酶活性与产物的原因。

有研究表明,通过不同途径改善机体的抗氧化能力,可以提高动物的生长性能[24]。胡尧等[25]也通过对仔猪血液中抗氧化指标的检测结果说明,饲粮添加 NAC可增强仔猪机体抗氧化能力,进而缓解 LPS刺激导致的生长抑制。本次试验中仔猪空肠黏膜中抗氧化指标的结果也说明,饲粮添加 NAC可增强仔猪机体抗氧化能力,进而缓解 LPS刺激导致的生长抑制。

4 结 论

①LPS多次刺激使仔猪肠道氧化酶激活,抑制抗氧化酶的活性,导致有害自由基产生和氧化产物增多。

②饲粮中添加 0.05%NAC能有效缓解 LPS刺激引起的负面影响,提高肠黏膜的抗氧化能力,并可能通过此途径缓解 LPS刺激引起的生长抑制。

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