马铃薯块茎组织特异性启动子GBSS的克隆及序列分析

陈国梁，陈宗礼，齐向英，贺晓龙

（陕西省延安大学生命科学学院/陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，716000）

马铃薯块茎组织特异性启动子GBSS的克隆及序列分析

陈国梁，陈宗礼，齐向英，贺晓龙

（陕西省延安大学生命科学学院/陕西省区域生物资源保育与利用工程技术研究中心，716000）

利用PCR技术从马铃薯陇薯3号基因组DNA中扩增出长度约为600 bp的DNA片段，经与T载体连接，测序表明，克隆到的DNA片段大小为599 bp，该序列与Genebank中已公布的GBSS启动子序列同源性为99.67%；采用植物顺式调控元件数据库PLACE和PlantCare对其进行序列分析，结果表明，该片段含有启动子的保守序列TATA-box和CAAT-box。此外，还具有诸如TAACAAA、CTAACAC、CTCTT及CACT等序列，而这些特异序列可能是基因特异表达所必须的。

马铃薯；组织特异性；启动子；PCR

随着基因工程技术的迅猛发展及日趋成熟，该技术在植物遗传育种及性状改良等应用方面日益显示出极高的价值。启动子基因工程载体的主要构成原件，是调控基因表达的“开关”，对外源基因的表达水平影响很大，无论是基础研究还是应用研究，人们都希望能够充分利用启动子来准确控制外源基因在植物体内的表达[1～4]。组织特异性启动子又称为器官特异性启动子，在该启动子调控下，外源基因的表达一般只发生在某些特定的器官或组织部位，并往往表现出发育调节的特性。其最大的优点是它所启动的外源基因在受体中仅在需要的部位特异表达，从而克服了组成型启动子启动的外源基因在受体植物中非特异、持续、高效表达所造成的浪费，增加转基因的效果[5]，因此人们对特异性启动子的研究和应用越来越重视[5～8]。基于此，该研究开展了马铃薯块茎组织特异性启动子GBSS的克隆及序列分析，为下一步实现外源目的基因在马铃薯块茎中的特异表达奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

陇薯3号马铃薯试管苗，由延安大学生命科学学院提供。试剂pEGM-T vector购买于北京泽平科技有限责任公司。限制性内切酶、连接酶、Taq酶均购自上海生物工程公司；寡核苷酸引物由上海生工生物技术公司合成；其他生化试剂和常规试剂均为国产分析纯。

1.2 试验方法

①马铃薯总DNA的提取 取马铃薯试管苗叶片，采用CTAB法[9]提取马铃薯总DNA。

②目的片段的扩增 在Genebank中查找已公布的马铃薯块茎patatin启动子序列并利用Oligo 6.0软件设计PCR扩增引物命名为G1（5'GTG GAA CGG AGA CAT GTT ATG A 3'）、G2（5'CGC ATG AAA TCA GAA ATA ATT GG 3'）；以所提取的DNA为模板，G1、G2作引物，在25 μL的反应体系（含Taq酶缓冲液、dNTP、Taq酶）中，95℃5 min、95℃ 40 s、54℃ 50 s、72℃ 60 s扩增 30个循环，72℃保温10 min。取5 μL PCR扩增产物进行电泳检测，将扩增的单一条带进行回收。

③PCR产物与T载体的连接及鉴定 取上述PCR回收产物与T载体连接，采用热激法转化大肠杆菌DH5α，并进行蓝白斑筛选，将经PCR鉴定的阳性质粒DNA用SacⅠ、XhoⅠ进行双酶切鉴定，将所得阳性重组子命名为pGEM-TG，并送往上海生物工程公司测序。

④序列分析 序列同源性分析采用DNAman软件完成，启动子序列调控元件分析利用植物顺势调控元件数据库PLACE[10]和PlantCare[11]完成。

2 结果与分析

2.1 目的片段的扩增结果

以马铃薯总DNA为模板扩增所得产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为600 bp的DNA片段（图1），条带单一、整齐、明亮。

2.2 重组质粒的PCR检测及酶切鉴定

以初步筛选出来的质粒DNA为模板进行PCR扩增及经SacⅠ/XhoⅠ双酶切后电泳检测，均获得大小约为600 bp的单一明亮条带（图2），片段大小与预期一致，表明外源DNA片段已经连接到T载体上。

2.3 测序结果

将所克隆的马铃薯启动子与Genebank中的马铃薯GBSS启动子序列进行对比分析表明 （图3），克隆到的序列大小为599 bp，与Genebank中已公布GBSS启动子序列的同源性为99.67%，说明GBSS启动子区序列呈现高度保守。

3 小结与讨论

我们所克隆的马铃薯块茎组织特异性启动子大小为 599 bp，片段内 AT碱基含量较高，占59.6%。采用PLACE及PlantCare在线数据库对其进行预测分析，结果显示（图3）：整个序列共有5个CAAT-box，分别在54，119，145，486 bp及578 bp处出现。CAAT-box一般决定着启动子的起始频率，5个CAAT-box表明该序列可能有较高的启动频率。561 bp处有TATA-box（TTTTA），其功能是保证转录得以精确起始；在207 bp及461 bp处分别有AT1-motif和12 bp回文序列，为马铃薯块茎光效应的顺式作用元件；在69 bp处有淀粉酶基因5'-上游保守序列（TAACAAA）；在239 bp处有种子储藏蛋白基因启动子核心序列（CTAACAC）；457 bp处有CTCTT结构，该序列具有根瘤细胞组织特异启动活性保守序列；515～535 bp处有6个CACT磷酸烯醇丙酮酸羧基酶基因顺式调控元件。以上序列分析表明，克隆的片段不仅具有完整的启动子表达调控元件，还具有可能与组织特异性相关的特异序列（如TAACAAA、CTAACAC、CTCTT及CACT等序列），而这些特异序列可能是基因特异表达所必须的[10～12]。

图1 目的片段PCR扩增产物电泳图

图2 重组质粒pGEM-TG的酶切与PCR鉴定

图3 马铃薯GBSS启动子序列分析

在植物基因工程研究中，利用组织特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，增加区域表达量，同时也可以避免植物营养的不必要浪费，并表现出发育调节的特性。Iglesias A A等[13]试验表明，将组成型表达的花椰菜花叶病毒启动子和大肠杆菌ADPG焦磷酸化酶（AGPP）的表达载体转入马铃薯植株中，淀粉的颗粒形态发生了变化，显微镜下可以看到淀粉颗粒出现了裂痕，但在马铃薯块茎特异表达启动子patatin的控制下，淀粉形态却没有发生任何改变。而对马铃薯品质的改良，归根结底是对贮藏器官——块茎中的基因表达进行调控，因此，我们已经克隆到的patatin基因启动子及本次克隆到的GBSS启动子，将作为一种重要的顺式作用元件，为其在马铃薯品质改良的基因工程研究中进一步应用奠定基础。

[1]李姗姗，迟彦，李凌飞，等.启动子克隆方法研究进展[J].中国生物工程杂志，2005，25（7）：9-16.

[2]夏江东，夏平.高等植物启动子功能和结构研究进展[J].楚雄师范学院学报，2005，20（3）：41-48，52.

[3]于翠梅，马莲菊，张宝石.特异性启动子在植物基因工程中的应用[J].生物工程学报，2006，22（6）：882-890.

[4]宋扬，周军会，张永强.植物组织特异性启动子研究[J].生物技术通报，2007（6）：21-24.

[5]王淼，王旭静，唐巧玲，等.高等植物绿色组织特异表达启动子研究进展[J].中国农业科技导报，2010，12（2）：33-37.

[6]李翠，谢华，徐勇，等.桃PpMADS1基因启动子的克隆及功能分析[J].中国生物工程杂志，2010，30（5）：57-62.

[7]林元震，张志毅，郭海，等.杨树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）基因启动子的克隆与分析[J].基因组学与应用生物学，2009，28（3）：445-449.

[8]王静澄，李昊，崔东清，等.毛白杨PtSEP3-1基因启动子的克隆分析及其表达载体构建[J].基因组学与应用生物学，2010，29（2）：239-244.

[9]J.莎姆布鲁克著.黄培堂译.分子克隆实验指南[M].北京：科学出版社，1992.

[10]http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalscan.html[DB/OL].

[11]http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html[DB/ OL].

[12]Liu X J,Prat S,Willmitzer L,et al.Cis regulatory elements directing tuber-specific and sucrose-inducible expression of a chimeric classⅠ patatin promoter/GUS-gene fusion[J].Mol Gen Genet,1990,223(3):401-406.

[13]Iglesias A A,Barry G F,Meyer C,et al.Expression of the potato tuber ADP-glucose pyrophosphorylase in Escherichia coli[J].The Journal of Biological Chemistry,1993,268(2): 1 081-1 086.

Cloning and Sequencing the GBSS of Potato Tuber Tissue-specific Promoter Region

CHEN Guoliang,CHEN Zongli,QI Xiangying,HE Xiaolong
(College of Life Science,Yan'an University/Shanxi Engineering&Technological Research Center for Conversation& Utilization of Regional Biological Resources,Yan'an,Shanxi 716000)

The GBSS gene promoter region was amplified from solanum tuberosumn genomic DNA by polymerase chain reaction(PCR)and cloned into the T-vector.The sequence analysis showed that the sequence size was 599 bp,its homology was 99.67%with published sequence of the GBSS promoter in Genebank.Using PLACE and PlantCare sequence database analysis showed that the fragment containing the conserved promoter sequence,such as TATA-box,CAAT-box.In addition,the fragment containing TAACAAA,CTAACAC,CTCTT and CACT specific gene sequences may be necessary for specific expression.

Potato;Tissue-specific;Promoter;PCR

10.3865/j.issn.1001-3547.2011.08.008

陕西省教育厅省级重点实验室重点科研计划项目（2010JS065），延安市科技发展计划项目（2010kn-03），延安大学专项科研基金项目、延安大学大学生科技创新训练项目（YD2008-106）

陈国梁（1974-），男，硕士,讲师，研究方向为植物生物技术

陈宗礼，通信作者，E-mail：zongli_chen@yahoo.com.cn

2011-03-15