自然界中不可培养微生物的研究进展

彭伶俐，王琴，辛明秀

(北京师范大学生命科学学院，北京100875)

环境中存在的微生物估计达到105～106种，但在实验室培养基中可分离鉴定的种类数量较少。国际原核生物分类学委员会证实:自从平板培养技术应用以来，发现的原核种类只有7 031种［1］。这种差别可能是由于许多微生物的不同生长状态比如休眠期不能根据培养基成分的变化及时调整自身生长，导致在平板中无法计数［2］。放射自显影技术及直接活菌计数都表明平板中50%甚至90%的细菌细胞保持代谢活性［3］，但却不能在固体培养基上形成菌落，从表观上认为这类微生物是不可培养的微生物。不可培养微生物是一个巨大的微生物资源库，其中蕴藏着丰富的新基因。对其进行深入研究可充分认识微生物物种的多样性，了解生物进化及微生物系统发育学信息。研究不可培养微生物的代谢多样性可发现新的代谢途径和新的代谢产物。不可培养微生物的研究开拓了微生物学研究的新领域，不仅在基础生物学研究中具有意义，同时发现新的物种、新的基因和新的代谢产物，将对发现新化合物特别是新药开发具有积极意义。

1 微生物不可培养的原因及限制因子

1.1 部分微生物生长缓慢，尚没有敏感检测技术

自然环境中许多微生物都聚集生长，适合实验室培养条件下生长的微生物快速繁殖，大量摄取了培养基中有限的营养成分，从而使生长缓慢的微生物得不到充足的营养使生长受到抑制;某些微生物即使能够在低浓度营养条件下生长，但在特定的培养条件下不能长成肉眼可见的菌落;还有一类生存在寡营养环境下的微生物在平板培养基中不形成菌落，而是在表面扩散生长，仅形成几个细胞组成的小型集合;此外，衡量微生物生长状况的常规方法比如比浊法和计数法等都不能检测到这些微生物，表观上被认为“不可培养”。现在比较成熟的是用微毛细管或光学镊子进行的单细胞分离技术，这种方法可以从微生物群落中鉴定出目的细胞［4］。这种技术需要严格的实验条件，同时由于对目的细胞的代谢认识不足，以致于无法掌握适宜它们生长的决定因子。另一方面，由于缺乏清晰直接的形态学特征也很难在一个复杂的微生物群体中鉴定出需要的目的细胞。分子生态学和宏基因组学显著增加了对遗传多样性的认识，但这些技术并不能完全检测编码微生物生命的整个遗传多样性的内容［5］。

1.2 培养基中的营养成分相对比较丰富

自然界中可以利用高浓度营养物质的微生物很少，大多数微生物处于“贫营养”生长状态。实验室中通常将需要贫营养的微生物置于丰富的营养环境中，微生物早期会快速生长，但同时产生大量的、微生物自身难以调节的过氧化物、超氧化物或羟基自由基等“毒性氧物质”，该类物质快速、过量的积累会破坏微生物细胞的内膜结构，由此产生一些应激机制如SOS来修复微生物［6］，未及时修复的微生物将会死亡或表现为不可培养。

1.3 忽视了环境中微生物之间的相互作用

自然环境中微生物之间的相互关系非常复杂。共生是至少有一个群体为另一个群体提供其必需的生长因子从而使微生物群体获利。当它们之间的距离靠近，本来不能生长的微生物得到另一类微生物提供的生长因子变得可以生长，而当微生物之间距离较远或不存在时则互不干扰或者干扰程度较低导致这些微生物不可培养［6］。另一种关系是群体感应。它是微生物间通过感应一种信号分子来判断群体密度和环境的变化，启动相应的基因作出协调统一的应答，从而调节群体的生长。当微生物的群体密度较低时，自身诱导素合酶基因产生一个基础水平表达，引起自身诱导信号产生，这些信号在细胞外扩散并且立即在周围环境中被稀释。而群体密度不断上升，引起自身诱导素在细胞周围不断积累，激活特定的转录调节蛋白抑制它的活性，致使微生物其他表型的活化［7-8］。微生物之间还存在其他类型的关系，在实验室培养条件下，单纯地将待培养的微生物与其他相关的微生物群体分开，物种之间的信息交流被阻断，微生物因缺乏必需的生长因子和信号分子而无法生长，表现为不可培养。

1.4 缺乏足够的认识，在实验室条件下无法实现原位培养

微生物的生存环境和自然条件相当复杂，比如:微生物的多样性、自然环境中的化学因素、环境中生物与非生物因素之间的相互作用以及微生物水平上的全球生态系统的平衡等。因此，没有或无法完全模拟微生物的自然生存条件，而通常只是将培养条件进行改善，如将微生物置于恒温、恒定转速、黑暗的环境中;将微生物限制在固体培养基或不搅动的液体介质中;替换微生物的营养组分或者缺少某种化学因子等。对微生物培养条件的认识需要逐渐探索，如在培养Spirochaetes(螺旋体)的培养基中一直添加能够使固氮酶失活的微量钨元素［9］，然而最近发现它也能够在钨缺少的培养基中通过固氮的方式生长。此外，自然界中大部分微生物以群体的形式生长来交换中间代谢产物和信号分子，因此在实验室中无法模拟原位生长的群体培养。

2 改善不可培养微生物可培养效率的方法

2.1 分散群体微生物

一种方法是在固体培养基上重复划线，目的是将微生物从群落中分离出来;另一种是在液体培养基上进行一系列重复的稀释来分离细胞。通过这些方法已经纯培养出许多种类微生物，而这些种类所属的门类没有或者只有很少代表物种［10］。然而用这些分离方法培养出的种类一般是生长迅速的微生物。

2.2 常规培养方法的改进

2.2.1 培养基的改善①添加非传统的碳源、电子供体与受体:2001年Uphoff等［11］将北海的海水样品在添加了多种不同碳源和复杂化合物的培养基上发现，它比仅含有一种碳源培养基上生长的微生物种类和数量都多。单一碳源分离的菌种几乎完全属于变形菌，而在复合的培养基上则分离到4种其他门类的代表物种。2005年Kopke等［12］在培养基中加入多样的电子受体和碳源从地下煤沉淀物中分离出新种类的微生物。最近，由特殊的原核生物生态群落催化的新还原产物也被用于丰富传统培养基的类型，并且发现了新的种类［13］;②采用低浓度营养成分培养基或者加入具有毒性氧降解能力的物质:高浓度营养成分的培养方法由于产生毒性氧物质导致所培养的微生物数量和种类都减少，Aagot［14］发现在低浓度营养基质的培养基上培养的微生物较多，但是营养成分浓度过低也使微生物数量下降［4］。减少毒性氧物质的产生也是提高微生物可培养性的一个有利方法。增加多聚物作为碳源，因为多聚物只有被分解成小分子物质才能被利用，这样微生物在短时间内不会受到毒害作用，有效地减缓了受毒害的速度［5］。减少培养环境中的氧分压也可以减弱由充足的氧气而导致毒性氧的伤害［8］。同时，在培养过程中添加过氧化氢酶、丙酮酸钠、α-酮戊二酸、二硫代二丙酸等具有毒性氧降解能力的物质也可以大大提高微生物可培养性［9-11］;③增加信号分子来维持微生物之间的相互作用:氮酰高丝氨酸内酯可以有效地提高微生物可培养性［4-6］，基于这个发现，用于多种基因调控的信号分子cAMP相对于氮酰高丝氨酸内酯更能够促使微生物的生长，提高了微生物的可培养性［14］。有些细菌例如藤黄微球菌可以分泌一种促进复活因子能够有效地恢复处于休眠期的革兰阳性菌的活性［15］;④添加酶、抑制细菌生长的抗生素或者其他抑制剂:添加酶来培养一些产生活性氧的物种［16］，添加某种抑制剂来抑制不希望生长的微生物，例如引入抗生素作为一种新型的能源抑制其他细菌的生长［17］;⑤其他类型凝固剂代替常用的琼脂:常规的培养基中用琼脂作为凝固剂，但是它对某些微生物具有一定程度的毒害作用，降低了可培养的微生物数量及种类。采用古兰糖胶，对微生物没有毒害作用，而且凝固效果比琼脂更好［18］。

2.2.2 培养条件的改变延长培养时间、降低接种量浓度都可以培养出不可培养微生物。有些微生物属于寡营养菌，比如在合适的培养基上培养时间延长至3个月，就可长成肉眼可见的菌落［6，10，18］，但是培养时间不能无限延长，培养时间越长，对微生物培养环境的无菌要求就越高［5］。降低接种量浓度也能够使活菌数增加，这种菌并不因为接种量的降低影响它们群落的形成［19］。

2.3 模拟自然生存环境

目前，2种新颖的自制培养仪器已经发展成熟，分别是扩散盒培养和含有有机或无机物质的原位群体载体培养。扩散盒由一个滤膜组成，它只允许培养环境中的化学物质和低分子量产物的通过而限制细胞通过，化学物质穿过薄膜与周围环境因子交换，可保证微生物群落间作用的存在，提高微生物可培养性［20］。土壤、海洋、活性淤泥都可以在扩散盒中培养出不可培养微生物。原位群体载体培养能够有效地克服原核生物黏附在固体表面导致的生长限制，很多文献内已经描述了不同载体的自然生态系统，例如陶瓷、钛装置、多孔无机基板、聚氨酯泡沫塑料等载体。包有选择性底物的原位集合物也可以有效地培养出目的微生物［21］。此外，有些特殊装置仅模拟一个或者几个重要的物化因素来培养新的微生物。2009年Zeng等［22］模拟高压环境从最深的高温喷火口分离出嗜高压和高温的古生菌。还有一种是流动装置，可以在自然环境原位温度、压力和液体流动的条件下连续培养，成功模拟深海环境中液体化学成分的变化。2007年Houghton等［23］利用这种装置培养出新的微生物。

2.4 微生物群体培养

自然环境中微生物之间有些是通过交换代谢产物或者特异信号分子进行直接的细胞交流，有些是竞争有限的生存环境［24］，有些是共同利用微量元素(如维生素)和螯合剂，因此单一的微生物培养不能完成复杂的细胞间相互交流。2个典型的群体培养的例子是多细胞培养装置和生物膜，都可以实施单个物种培养不可能实现的多功能培养。复杂有机物的纤维素降解或甲烷转换就是利用多细胞装置实现的［25］。此外，小部分共生的微生物可以在实验培养基上添加一些微量元素、共底物等可以培养出来。群体培养能够有效地培养出共生和互生微生物。利用透析膜反应器的群体培养方法已经成功的从厌氧淤泥中培养出厌氧嗜热的降解谷氨酸的微生物［26］。

2.5 高通量培养

为了从自然环境中筛选出新的生物化学分子和酶类，发展了不依赖培养基的高通量培养方法。1993年Button［27］提出稀释培养法，即将微生物群体稀释至痕量时(1～5个细胞/mL)，寡营养微生物可以不受其他优势微生物的干扰，因而可以被培养出来。随后，Connon［28］采用稀释培养法将微生物样品稀释至痕量后，采用微量细胞培养板和荧光原位杂交技术(FISH)分离培养并检测出许多微生物，这种方法不仅能有效提高微生物的可培养性，还可在短期内检测出目标培养物，并进行大量的培养，提高工作效率。2005年Zengler等［29］提出细胞包囊法，将微生物样品先进行稀释，然后乳化，部分微生物形成了仅含单个细胞的胶状微滴，随后将其装入层析柱内，让培养液连续通过层析柱进行流态培养。这种方法已从不同样品中分离出多种细菌和真菌。2007年Ingham等［21］提出多孔微生物培养芯片，它是由一种独特的多孔陶瓷做成，被分割成数千个小室，在小室中进行独立的微生物培养，营养分子可以通过多孔膜四处扩散维持微生物的生长。

到目前为止，不可培养微生物的培养方法仍然存在一定的局限性。这主要是由于缺乏对微生物的多样性、生存环境以及在生物进化中地位的认识，也由于实验室中无法设计微生物生长的原位环境实现群体培养。因此，必须全面理解微生物生理适应性与群体行为，发展和革新培养技术，改变微生物培养方式，设计尽可能接近微生物生活的自然环境，培养出更多的“不可培养微生物”，从中发现新的酶类和化合物，使其应用于制药业、农业、化工业等领域。

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