糖尿病内皮祖细胞的研究

王晓霞综述 赵 明审校

糖尿病内皮祖细胞的研究

王晓霞1综述 赵 明2审校

本文2010—12—20收到，2011—02—18修回，2011—02—23接受

自1997年Asahara从人外周血单个核细胞首次分离出内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells，EPCs）［1］以来，人们对其进行了大量研究。结果表明，EPCs是具有迁移、增殖、粘附和分化成内皮细胞功能的前体细胞，不仅参与胚胎期血管的形成，也参与成人新生血管的发生。目前把表达CD34和血管内皮生长因子受体（KDR）的细胞定义为 EPCs（CD34＋KDR＋）［2］。有报道称1 型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus，T1DM）及2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）患者外周血中存在EPCs数量减少及功能障碍［1］。深入研究EPCs在糖尿病，尤其在伴发血管病变中的重要作用，对于认识EPCs作为糖尿病血管病变的一种新的发生机制及使其成为潜在的治疗靶点具有重要意义。

1 EPCs概述

骨髓、脐血、外周血均含有EPCs，且三者之比约为15∶10∶1［3］。将外周血单个核细胞接种于纤维连接蛋白包被的培养板上，培养至第4天时，培养板上出现呈纺锤体形状的贴壁细胞，称为早期EPCs；7～14天时部分贴壁细胞形态呈鹅卵石样改变，类似于成熟的内皮细胞，称为晚期EPCs。早期EPCs表达CD14、CD45，高表达血管内皮生长因子（Vas-cular Endothelial Growth Factor，VEGF）、白细胞介素-8（In-terleukin，IL-8）、粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony—Stimulating Factor，G-GSF）。免疫 组 化 鉴定提示，晚 期EPCs主要表达成熟内皮细胞标记物血小板内皮细胞粘附分子 （Platelet／endothelial Cell Dhesion Molecule-1，PECAM-1）、血管性假血友病因子（von Willebrand Factor，v WF）、血管内皮细胞钙粘蛋白（Vascular Endothelial Cadherin，VEC）、内皮细胞氮氧化物合酶（Endothelial Nitric Oxide Synthase，eNOS），且增殖能力较早期EPCs更强，体外生存时间也更长，具有形成血管样结构的能力［4］。此外，晚期EPCs还表达CD34、KDR及AC133，但对AC133的表达不同于造血祖细胞和白细胞，因为它很快就消失了，现在体外研究的EPCs主要表达CD34及KDR（CD34＋KDR＋）。

2 糖尿病患者外周血EPCs的变化及机制

2.1 血糖水平对EPCs的影响

Churdchomjan等［5］采用不同浓度的葡萄糖（7.8、10.5、13.5、16.5、19.5mmol／L）干预外周血来源的 EPCs不同时间，观察EPCs的数量（7天）、增殖能力（14、21天）及凋亡情况（7、14天），结果发现葡萄糖呈量效关系减少EPCs的数量（P＜0.05），呈量效和时效关系降低EPCs的增殖能力（P＜0.05），呈量效和时效关系增加EPCs的凋亡率；该研究还显示，糖尿病患者外周血中EPCs的数量与患者空腹血糖及糖化血红蛋白（Hb A1c）呈负相关，表现为EPCs数量减少，并认为这种减少与EPCs寿命缩短或骨髓EPCs动员减少有关，其中寿命缩短可能由于细胞增殖减少和细胞死亡加速所致。研究表明，高糖条件下，静息状态的EPCs不断累积时，增殖状态的EPCs数量在不断减少［6］，这种减少与P16及P21蛋白表达水平的上调有关。因为P16及P21均在细胞周期调控表达中起重要作用，属于细胞周期蛋白激酶抑制蛋白，对G1／S转换起负调节作用，而P16及P21蛋白表达水平的改变与几种类型细胞的凋亡有关。还有研究表明，高糖能够上调在EPCs增殖、存活及分化中起重要作用的E—Twenty six（ETS）转录因子，继而增强表达非内皮ETS靶基因基质金属蛋白酶类（Matrix Metalloproteinases，MMPs）及CD115，抑制表达内皮标志物CD105，影响EPCs向内皮细胞的分化，致EPCs功能活动受阻［7］。也有研究认为，高糖通过p38促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，p38MAPk）加速EPCs衰老，且减少循环中EPCs数量［8］，而一氧化氮（NO）的供体硝普钠（Sodium Nitroprus-side，SNP）［9］或p38MAPK阻滞剂SB230580明显改善高糖对EPCs数量和增殖的抑制作用［5］。此外近来研究表明，磷脂酰肌醇-3激酶（Phosphatidylinositol 3’Kinase，PI3K）／丝氨酸—苏氨酸激酶（Serine-Threonine Kinase，AKT）／eNOS［PI3K／AKT／eNOS］信号转导通路在阻止高糖致细胞损伤中也发挥重要作用，PI3K／AKT能够阻止EPCs死亡，导致细胞存活及激活eNOS、增加NO产量。

2.2 胰岛素、胰岛素抵抗对EPCs的影响

体外研究表明，胰岛素能够增加培养基中EPCs，尤其是早期EPCs和单个核细胞的数量［10］。超生理剂量胰岛素影响EPCs从骨髓动员至外周血以及降低EPCs与受损内皮细胞的结合能力，取决于内皮细胞胰岛素样生长因子（Insulin-Like Growth Factor，IGF）-1及其受体-2（IGF-R2），因IGF—1／IGF-R2是 EPCs的主要管理者［11，12］。超生理剂量胰岛素甚至能够产生促氧化效应，与糖尿病患者胰岛素抵抗所达到的超生理剂量的胰岛素产生的促动脉粥样硬化效应可能有关［13，14］。胰岛素抵抗通过减少细胞周期蛋白 E（Cyclin E）、细胞周期蛋白依赖激酶-2（cyclin dependent kinase-2，cdk-2）及增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Anti-gen，PCNA）的表达而减少EPCs增殖，通过过度表达caspase-3、激活细胞内蛋白降解程序而致细胞凋亡［15］。胰岛素与受体结合，通过胰岛素受体底物激活PI3K途径，直接磷酸化e NOS，使eNOS活性增强，NO产生增加；而胰岛素抵抗通过增加内皮细胞脂肪酸氧化而降低eNOS活性，是导致糖尿病患者发生动脉粥样硬化和心血管疾病的另一种潜在机制［16］。研究表明大多数人体组织中eNOS受损与高糖及糖尿病相关，短期使用胰岛素并不能逆转eNOS磷酸化作用受损，不能增加NO产量，而促进EPCs动员及伤口愈合［16］。在体内，胰岛素能够阻止细胞迁移和新生内膜的增长，增强EPCs功能，改善动脉损伤后的再内皮化［17］。

2.3 eNOS、MMPs对EPCs的影响

骨髓来源的EPCs在血管生成及归巢到外周血中对伤口愈合起关键作用。eNOS的表达及磷酸化作用对于EPCs的存活、迁移、血管发生至关重要。骨髓中EPCs在组织缺氧所诱导释放的血管内皮生长因子A及由骨髓间质eNOS活化而增加NO释放的作用下动员至外周血中，随后在缺血组织诱导表达的，作为EPCs归巢的信号基质源因子-1α（Stromal Cell-Derived Factor，SDF-1α）的趋化作用下趋化至缺血组织，参与组织水平的血管生成及伤口愈合［18］。来源于eNOS的NO可通过亚硝基化和提高组织VEGF的表达来促进EPCs的动员，VEGF还通过对AKT和e NOS 1177位点的丝氨酸磷酸化作用反馈促进EPCs的动员和血管生成［8］。骨髓eNOS活化功能受损致EPCs动员至外周血中减少可能由骨髓间质基质细胞和淋巴细胞数量减少所致。EPCs减少能够被高压氧治疗所逆转［18］。MMPs是一组具有类似结构及共同生物化学性质的金属依赖性蛋白水解酶超基因家族，是细胞外基质的主要降解酶系统，能降解多糖以外的所有细胞外基质成分如胶原及弹性蛋白，其活性受金属蛋白酶组织抑制剂（Tissue Inhibitor of Metalloproteinase，TIMPs）的调节。迄今发现的28种 MMP中，MMP-2及MMP-9是Ⅳ型胶原酶的两种存在形式。近来研究表明，糖尿病小鼠的组织缺血，可诱导VEGF、缺氧诱导因子-1α（Hy—poxia-Inducible Factor，HIF-1α）、白介素-1β（IL-1β）表达受损，而使 MMP-2及 MMP-9表达过度，TIMPs表达下降［19］。HIF-1α是VEGF的转录因子，VEGF动员EPCs从骨髓中进入外周血中，HIF-1α活化可调节VEGF的表达。正常小鼠中，VEGF、HIF-1α及其诱导剂IL-1β表达均显著增加，且同时达峰值。糖尿病小鼠的VEGF表达受损与HIF-1α及IL-1β的低表达相关。其机制可能是高糖通过氧化应激和糖基化终产物上调MMPs的表达［20］，或抑制NO的作用而增强MMPs的活化［21］。MMPs一方面通过使kit膜型配体变成可溶解形式，促使EPCs动员至外周血中［22］，另一方面通过自身拮抗作用拮抗VEGF的效应［23］。

2.4 外周血管病变（Peripheral Vascular Disease，PVD）与EPCs

PVD是T2DM中一种普遍而严重的并发症，T2DM的侧支血管代偿不足是PVD发病的原因之一。踝臂指数（Ankle Brachial Index，ABI）是下肢血管病变最客观的诊断试验，也是检测心血管风险最可靠的标记物。EPCs进行性减少平行于T2DM外周血管病变的严重性，CD34＋KDR＋细胞水平负相关于ABI、下肢动脉闭塞的临床状态及颈动脉狭窄的最大程度［2］。EPCs的减少在PVD的病理生理中起作用，因为EPCs减少促成内皮功能障碍，加速动脉硬化进程，导致血管病变，如糖尿病足部损害等［23］。研究发现，下肢血管缺血患者用促血管生成治疗的临床效果并不理想［24］，提示该类患者可能缺少血管生成最原始的细胞EPCs，而仅靠细胞因子是不够的［25］。近来，局部缺血综合症患者应用EPCs进行细胞治疗时发现，骨髓来源的EPCs若其分化能力及血管形成能力受损，则不能用于血管治疗［26］，但可在EPCs的体外扩增过程中进行基因转导来解决EPCs的这些功能缺陷。进行表型调整的EPCs的应用可能减少移植所需EPCs的数量，尤其对自体移植更具优势。

3 结语

EPCs参与出生后器官和组织的血管新生及受损血管的修复以及维持血管壁的完整性。随着研究的不断深入，EPCs将会在改善组织缺血与血管再生方面发挥重要作用。如应用EPCs治疗糖尿病各种血管并发症将成为一个新的治疗靶点，对增殖型视网膜病变通过控制局部的EPCs聚集与分化，从而减少不良血管的生成、改善愈后等，均有利于提高糖尿病患者的生存质量。

本文作者简介：

王晓霞（1989～），女，汉族，硕士研究生

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R587.1

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