细鳞鱼气单胞菌的分离、鉴定及药敏试验

刘洋,徐革锋,陈玉春,李永发,牟振波

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,黑龙江哈尔滨150070;2.东北农业大学水产养殖系,黑龙江哈尔滨150030)

细鳞鱼气单胞菌的分离、鉴定及药敏试验

刘洋1,徐革锋1,陈玉春2,李永发1,牟振波1

(1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所,黑龙江哈尔滨150070;2.东北农业大学水产养殖系,黑龙江哈尔滨150030)

从患病细鳞鱼Brachymystax lenok体内分离出两种菌株(记为BAS和BAH),均属于革兰氏阴性短杆菌,无芽孢,无荚膜,多数呈单个排列,极端有单鞭毛。对两种菌株的菌落形态鉴定结果表明:BAS的菌落呈圆形,为浅黄色,半透明,无水溶性色素;BAH的菌落也呈圆形,中央微高,为灰白色。经API 20NE细菌生化鉴定,BAS和BAH菌株分别为温和气单胞菌Aeromonas sobria和嗜水气单胞菌A.hydrophila,其鉴定率分别为98.1%和99.3%。注射剂量为1×107CFU/mL时表现出较强的致病性,感染12 d时,细鳞鱼的死亡率为100%。药物敏感试验结果表明:两种菌株对妥布霉素(TOB)、四环素(TET)、庆大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、氟哌酸(NOR)、环丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LVX)高度敏感;对呋喃唑酮(FUR)、呋喃那斯、氯霉素(CHL)、复方新诺明(TST)中度敏感;对阿奇霉素(AZI)、红霉素(ERY)不敏感。

细鳞鱼;嗜水气单胞菌;温和气单胞菌;药敏试验

温和气单胞菌Aeromonas sobria主要分布于水环境中,是一种重要的条件致病菌。嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila是一种有动力的气单胞菌,广泛分布于各类水环境、土壤和人类粪便中,对水产动物、畜禽和人类均有致病性,可引起机体出现败血症、痢疾和伤口感染等[1-3]。目前嗜水气单胞菌是引起鱼类疾病的重要病原菌,由该菌引发的败血症在东南亚国家通常称之为流行性溃疡败血综合症(Epizootic ulcerative syndrome,EUS),中国大陆则称该类疾病为暴发性流行病[4]。近年来,由嗜水气单胞菌引起的水产动物细菌性败血症的流行,给水产养殖业造成严重的经济损失,该病已成为水产养殖中所关注的重大问题[3]。由于水产养殖中鱼类的养殖密度不断增大,导致养殖环境恶化,细菌疾病频发,因此,需使用大量的抗生素药物来控制由细菌所引发的暴发性疾病,这就导致了抗生素药物使用泛滥。嗜水气单胞菌病原菌在长期的使用过程中产生多种耐药性的菌株,给该病的防治带来后患,同时也严重影响了水产动物源性食品的质量安全,控制抗菌素的滥用已迫在眉睫[5]。

细鳞鱼Brachymystax lenok属于国家二级保护动物[6],是中国名贵的鲑科冷水性经济鱼类,具有很高的营养和食用价值。细鳞鱼的全人工繁育已经成功,目前正开始大面积推广示范养殖。在高密度养殖细鳞鱼过程中,该鱼会出现体表、鳍条充血以及体表溃烂等现象。本研究中,作者对该病的病原菌进行了分离及鉴定,旨在为该病的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验用细鳞鱼Brachymystax lenok取自黑龙江水产研究所渤海冷水鱼试验站,体质量为20～25 g,体长为15～17 cm,暂养于室内玻璃水族箱(0.9 m×0.5 m×0.5 m)中,有效水体积为180 L。以充分曝气除氯的自来水作为循环水源,采用自动控温装置将水温控制在(16±1)℃,24 h持续曝气充氧,采用循环流水养殖。日投喂量为鱼体质量的1.5%,早、中、晚定时投喂,暂养14 d确认健康无病后确定为感染用试验鱼。试验用药品、药敏纸片及生理生化快速检测试剂盒均购自杭州天和生物

制剂公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离、纯化及鉴定 在严格无菌条件下,用酒精擦拭患病鱼的体表,解剖,分别取心脏、肝胰脏、脾、肾以及血液和患病部位的糜烂组织接种于营养琼脂平皿,27℃下培养24 h后,选择典型可疑单菌落进行纯化,同时对纯化菌株应用API 20NE系列进行生化鉴定、菌株形态和生化特性试验[7]。根据《常见细菌系统鉴定手册》[8]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[9]对菌株进行鉴定。

1.2.2 人工感染试验 设感染试验组和空白对照组,根据不同菌液浓度进行分组注射。取被鉴定菌株培养24 h,用无菌生理盐水洗下菌苔,采用平板计数法,将菌液稀释成0.25×107、0.5×107和1.0× 107CFU/mL的菌悬液。选择暂养2周以上且健康的细鳞鱼150尾,分别给试验组鱼注射不同浓度的菌悬液,注射剂量为0.5 mL/尾,注射部位为鱼的胸鳍基部,给对照组鱼注射相同剂量的无菌生理盐水。每组注射感染5尾,空白对照组和试验组均设3个平行。将试验组和对照组鱼置于同等条件下暂养。试验期间不投喂饲料,pH为7.0～8.0,水温为(16±2)℃,溶氧＞7 mg/L。连续观察两周,记录鱼的死亡情况。

1.2.3 药物敏感性试验 药敏试验采用K-B法,参照NCCLS规范[8]进行。用灭菌蒸馏水洗下培养24 h的培养物,采用平板计数法,将菌液稀释至终浓度为1.5×109CFU/mL,分别涂布水解酪蛋白琼脂(MH)平皿。选择13种药敏纸片均匀贴于平皿,每种药敏片设3个平行试验,每皿5片,27℃下培养18 h后测量抑菌圈直径,确定病原菌对不同药物的敏感程度。

2 结果

2.1 患病鱼特征

7—8月是鲑科鱼类细菌性疾病泛滥的季节,在养殖过程中发现有部分细鳞鱼体表及鳍条充血,体表充血处随之发生溃烂,病灶不断扩大形成大面积溃烂(图1-A),病灶不规则,同时鳍基部、下颌、鱼体两侧有不同程度的充血,病鱼摄食减少或不摄食,不久即死亡。解剖后发现腹腔积水,肠道内有少量或没有食物,肝胰脏呈花斑形,肾脏略有充血(图1-B)。

图1 患病鱼体表溃烂面病灶(A)和内脏病变(B)Fig.1 Symptom of skin canker(A)and pathological changes of purtenance(B)in Brachymystax lenok

2.2 革兰氏染色及病原菌的形态特征

本试验中共分离出两种疑似菌株,分别标记为BAS和BAH。经革兰氏染色显示,两种菌株均属于革兰氏阴性短杆菌,菌体呈短杆状,无芽孢无荚膜,多数单个排列,少数成对排列,极端单鞭毛。BAS的菌落呈圆形,光滑湿润,边缘整齐,为浅黄色,半透明,无水溶性色素。BAH菌落也呈圆形,光滑湿润,边缘整齐,中央微高,为灰白色。

2.3 微量生化鉴定结果

BAS和BAH菌株的鉴定结果见表1。两种菌株还具有一些产酸产气的特化反应,结果见表2。

表1 温和气单胞菌和嗜水气单胞菌的鉴定结果Tab.1 The identification of BAS and BAH in biochemical experiment

表2 温和气单胞菌和嗜水气单胞菌的特化性Tab.2 Biochemical characterization of the isolated strains BAS and BAH

2.4 药物敏感试验

本试验结果表明,两种菌株对妥布霉素(TOB)、四环素(TET)、庆大霉素GEN)、卡那霉素(KAN)、氟哌酸(NOR)、环丙沙星(CHT)、左氧氟沙星(LVX)高度敏感;对呋喃唑酮(FUR)、呋喃那斯、氯霉素(CHL)、复方新诺明(SIN)中度敏感;对阿奇霉素(AZI)、红霉素(ERY)不敏感。

2.5 人工感染试验

细鳞鱼分别在接种BAS和BAH菌株1周内开始发病,高浓度组试验鱼在接种菌株3 d后出现厌食、游动迟缓、反应慢的现象,并有少部分鱼死亡。2周内统计各组鱼的死亡情况,发现各试验组鱼的死亡率不同,随着注射菌液浓度的增加,细鳞鱼的死亡率也在增大(表3)。

表3 腹腔注射人工感染试验Tab.3 Infection experiments with intraperitoneal injection

3 讨论

3.1 气单胞菌的致病性

温和气单胞菌和嗜水气单胞菌不仅能引起常规养殖鱼类患出血性败血症、败血性腹水病、溶血性腹水病及烂鳃病等疾病[10-11],而且还能导致人类患多种疾病[12]。董传甫等[13]、苏应兵等[14]和陆文浩等[12]分别报道了由嗜水气单胞菌和温和气单胞菌共同感染引起的日本鳗鲡败血腹水病、异育银鲫败血症和斑点叉尾鮰暴发性败血症。本研究中也发现类似情况。从发病细鳞鱼体内分离到两种杆菌,经过对其形态学特征和生理生化特征的初步鉴定,确定为气单胞菌属Aeromonas的温和气单胞菌和嗜水气单胞菌。通过人工接种试验,进一步证实细鳞鱼体溃烂、出血,肝胰脏呈花斑形,肾脏略有充血等症状是由嗜水气单胞菌和温和气单胞菌共同感染所致。

3.2 气单胞菌的鉴定

如果对养殖生产中的致病性细菌能够进行快速分离与鉴定,将对疾病的预防控制和治疗起到积极的作用。在气单胞菌表型鉴定中,马子行[15]从众多生化检验项目中优选出10项关键性指标,经多次试验应用,取得了可靠的鉴定结果,缩短了分离菌株的鉴定时间。目前对嗜水气单胞菌的研究较为深入[2-5,16-17]。陆承平[18]认为,革兰氏染色为阴性,氧化酶为阳性的细菌,只要在生化特征鉴定中出现葡萄糖产气,并发酵甘露醇、阿拉伯糖、七叶苷或水杨苷、蔗糖,鸟氨酸脱羧酶稍微阴性等6个指标符合,就可以判定为嗜水气单胞菌。本研究中分离菌的生化试验结果符合嗜水气单胞菌的基本特性,但生化结果还显示有温和气单胞菌的存在,说明是两种气单胞菌的协同作用导致细鳞鱼的非典型性的发病状况。

3.3 菌株的耐药性

本研究中分离鉴定的两株菌BAS和BAH分别为温和气单胞菌与嗜水气单胞菌。通过药物敏感性试验发现,这两种菌株对妥布霉素、四环素、庆大霉素等7种抗菌素高度敏感;对呋喃唑酮等4种抗菌素中度敏感;对阿奇霉素(AZI)、红霉素(ERY)呈耐药性。这与陆文浩等[12]和胡琳琳等[19]的试验结果存在一定差异。本研究结果表明,细鳞鱼感染的气单胞菌主要对两种抗菌药物存在耐药性,对绝大多数符合《渔用药物使用准则》的抗菌药物均有敏感反应。因此,在细鳞鱼感染气单胞菌疾病的治疗过程中,可选择多种药物治疗,在不使用违禁药物的同时,应最大限度地保证药物的治疗效果,避免盲目用药。

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Isolation,identification and drug sensitive test of Aeromonas from lenok Brachymystax lenok

LIU Yang1,XU Ge-feng1,CHEN Yu-chun2,LI Yong-fa1,MOU Zhen-bo1
(1.Heilongjiang River Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Harbin 150070,China; 2.Department of Aquaculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Two bacteria,BAS and BAH,were isolated from the dying lenok Brachymystax lenok,and were gramnegative,rods with polar single-flagella.The BAS colony was found to be round in shape,buff,and translucent, without water-solubility pigment,while BAH was round,hoar,and slight higher in the center.Thus the BAS and BAH were identified as Aeromonas sobria and Aeromonashy hydrophila by bacteria certification with the identification percent of 98.1%in the BAS and 99.3%in the BAH by API 20NE.The injection at a dose of 1×107CFU/ mL led to intense pathogenicity and 100%mortality in 12 days.The drug sensitive test showed that the stains had high sensitivity to tobramycin,tetracycline,gentamicin,kanamycin,norfloxacin,ciprofloxacin,and levofloxacin, and middle sensitivity to furaxone,furanace,chloramphenicol,trimethoprim and sulphame-thoxazole,and resistance to azithromycin and erythromycin.

Brachymystax lenok;Aeromonashy hydrophila;Aeromonas sobria;drug sensitive test

2095-1388(2011)03-0277-04

S941.42

A

2010-08-25

中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(201002,2009HSYZX-YZ-03);黑龙江省冷水性鱼类种质资源及增养殖重点开放实验室项目(201002,2009HSYZX-YZ-03);中国水产科学研究院冷水性鱼类增养殖生物学与鱼类生理学重点开放实验室项目(201002,2009HSYZX-YZ-03)

刘洋(1982-),男,硕士,助理研究员。E-mail:liuyanghrfri@gmail.com

牟振波(1961-),男,研究员。E-mail:hfishmzb@hotmail.com