脂肪源干细胞上皮分化在喉组织工程中的应用

孙希才 摘译 葛荣明 审校

上海同济大学附属同济医院耳鼻咽喉科(上海 200065)

声带瘢痕是一个较难解决的临床问题，尚缺乏有效的治疗手段，目前其主要的治疗方法是向声带中注射填充物或细胞，试图恢复声带浅层的振动性。声带振动受损主要是由于固有层细胞外基质的中断、胶原沉积增多、弹性纤维的丢失等引起。有证据表明声带注射细胞或基质对恢复声带黏膜波的作用是有限的。另外，从人的声带中获取成纤维细胞比较困难。现有的组织工程方法是将声带的成纤维细胞包被在一系列的支架上。用自体细胞来源的组织结构工程代替声带被覆黏膜可能成为严重声带瘢痕的治疗方式。实现该目标的第一步是构建类似于声带固有层和上皮层的三维细胞群基质。切除声带瘢痕后，用新的有组织结构的细胞外基质和上皮作为替代物，改善声带的振动功能。本研究便是介绍一种新的组织工程方法来构建声带被覆黏膜的替代物，以便恢复声带固有层和上皮的振动功能。通过脂肪抽吸分离获得的脂肪源干细胞是一种多功能干细胞，作为一种自体间质细胞的来源，已被广泛用来产生软骨细胞、成骨细胞和纤维细胞。脂肪源干细胞与骨髓源间质干细胞具有相似的遗传特征，可以分化成外胚层和内胚层细胞。本研究假设脂肪源干细胞在气体界面和特异性细胞因子的作用下可以分化成上皮细胞，而远离气体界面的细胞则可以分化为成纤维细胞。其方法是从UCLA血库获取冷沉淀物，-70℃保存备用。将解冻的冷沉淀物、牛凝血酶溶液以及细胞悬液按4:1:1混合形成纤维蛋白-脂肪来源的干细胞胶。在Transwell培养基板上形成凝胶，将一定量的细胞悬液直接加在胶上形成气体界面。可见在特定的生长因子和气体界面的培养下，整个三维培养基中可见胶原产生，在接近上皮层的细胞中胶原沉积较多；在表皮生长因子和气体界面培养下，E-钙黏蛋白(一种上皮细胞标志物)在三维培养基中阳性表达；在表皮生长因子和气体界面下培养8天后，培养基表面的细胞中细胞角蛋白呈阳性表达；在表皮生长因子的作用下培养14天后，接近气胶交界的细胞会出现较多的E-钙黏蛋白表达，包埋在基质中的细胞则无E-钙黏蛋白的表达，而波形蛋白阳性表达较明显。波形蛋白是一种在间质细胞系中表达的细胞骨架蛋白，声带固有层中的成纤维细胞阳性表达波形蛋白。在三维培养基中表达波形蛋白的细胞位于表达E-钙黏蛋白细胞的深层。本研究构建了声带黏膜的组织工程替代物，三维的纤维蛋白和脂肪源干细胞的水凝胶与声带的固有层和黏膜层有着相似的显微结构和特性。在本研究中，成人脂肪源干细胞可以双向分化成上皮细胞和间质细胞系，并且具有组织结构，表皮生长因子和气体界面是上皮分化的必备条件。本研究结果初步表明，利用组织工程制作声带替代物是可行的。