通心脉方对大鼠心肌缺血再灌注损伤AKt及p38αMAPK蛋白表达的影响*

郑晓丹,严世芸,秦仲君

(1.上海中医药大学附属曙光医院心内科,上海 200021;2.上海中医药大学基础医学院,上海 201203; 3.九江学院基础医学院病理生理教研室,江西九江 332000)

通心脉方由黄芪、川芎、血竭等 5味药物组成,是上海中医药大学严世芸教授在长期的医疗实践中总结出的治疗冠心病的经验方,临床疗效显著。前期研究显示,通心脉方能显著改善大鼠离体心脏缺血再灌注后心功能。本研究采用Langendorff离体心脏灌流方法模拟缺血再灌注模型,观察通心脉方对缺血再灌注大鼠心肌p-p38αMAPK、p-AKt及caspase-3等的影响,进一步探讨通心脉方的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动 物

SPF级健康Wistar大鼠96只,雄性,10周龄,体质量(300±20)g,购于中国科学院上海实验动物中心,实验动物质量合格证号:SYXK(沪)2007-2008。将动物按每笼 5～6只分笼饲养,实验期间提供足量的自来水及上海中医药大学实验动物中心提供的普通饲料,动物室保持 22℃,自然通风,相对湿度60%～70%,光照周期8:00-20:00。适应7 d后用于实验。

1.2 仪 器

ML176型Langendorfff离体心脏灌流装置, ML785型生物信号处理和分析系统,MLT1050型高精度压力换能器,产地澳大利亚;SPECTERA max190型Molecular Device酶标仪,产地美国;S-450D型BRANSON超声组织破碎仪,产地美国;HP图像扫描仪,产地日本;Smart View图像分析软件,上海复日科技有限公司产品。

1.3 药品与试剂

通心脉方由黄芪(产地内蒙)、川芎(产地四川)、血竭(产地云南)等5味药组成,全方共计生药52 g,购于北京同仁堂上海黄浦大药房。药品经上海中药标准化中心鉴定后,由上海中医药大学中药研究所采用醇提法提取,全方得率 29.57%。所得药液用含0.5%甲基纤维素的双蒸水配制,高、中、低剂量通心脉方混悬溶液分别含生药 1.7,0.85, 0.45 g/m L。卡维地洛,10mg/片,齐鲁制药有限公司产品,批号 20091117。p-p38αMAPK(Thr180/ Tyr182,9216)、p38αMAPK(9217)、p-AKt(Ser473, 4051)、AKt(2920)抗体,均购于Cell Signaling Technology公司;caspase-8(Lot40513)、caspase-3(Lot50706)分光光度法活性检测试剂盒,购于Biovision公司;大鼠TNF-αELISA试剂盒及兔抗GAPDH多克隆抗体(Lot20101013),购于妙通(上海)生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)(Lot20100916)、丙二醇(MDA)(Lot20100915)、过氧化氢酶(CAT) (Lot20100823)试剂,购于南京建成生物工程研究所;其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.4 动物分组

实验分 2批进行。第 1批:将 48只大鼠随机分为正常灌流组、缺血再灌注组、通心脉方大剂量组、通心脉方中剂量组、通心脉方小剂量组、卡维地洛组6组,每组 8只。正常灌流组全过程用 K-H液恒速持续灌流120 min,其余组心脏平衡10 min后停灌50min,再灌注60min。实验结束后取左室心肌液氮速冻后于 -80℃冰箱保存,用于caspase-8、caspase-3、SOD、CAT、MDA及TNF-α含量测定。第2批:分组同第 1批。正常灌流组全过程用 K-H液(单位为mM,NaCl 118,KCl 4.7,CaCl21.25, NaHCO325,KH2PO41.2,MgSO41.2,Glucose 11,pH 7.4,持续充以95%O2和5%CO2)恒速持续灌流75min,其余组心脏平衡10 m in后停灌50 min,再灌注15min(据文献[1]报道,p-p38αMAPK及p-AKt最大激活在缺血再灌注15min)。实验结束后,取左室心肌液氮速冻后于-80℃冰箱保存,用于p-p38αMAPK、p38αMAPK、p-AKt及AKt蛋白表达的检测。

1.5 给药方法

根据“人和动物按体表面积折算的等效剂量比值表”[2]折算,正常灌流组、缺血再灌注组予以生理盐水10μL/(g·d)灌胃,通心脉方大、中、小剂量组分别予含生药10.4,5.7,2.9 g/(kg·d)醇提物灌胃,卡维地洛组予以2μg/(g·d)灌胃,连续15 d。

1.6 模型的建立

造模方法参照文献[3]方法加以改进。大鼠末次给药后60min造模,腹腔注射肝素1 000U/kg抗凝,20min后腹腔注射戊巴比妥钠50μg/g麻醉,开胸,取出心脏固定于Langendorff装置上,用K-H液恒温恒流(37℃,12 mL/min)灌流。用眼科剪在左心耳根部剪 1个小口,将球囊通过左心耳插到左心室。向球囊内注入生理盐水,平衡期调整左室舒张末压(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)于8～10mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)之间。导管连接压力换能器,用 8道生理信号分析仪连续记录整个实验过程中左室收缩压(Left ventricular systolic pressure,LVSP)、左室发展压(Left ventricular development pressure,LVDP)、LVEDP、冠脉灌注压(coronary perfusion pressure,CPP)、左室内压最大变化速率(Peak positive and negativemaximal derivation of left ventricular pressure,±dp/dtmax)数值。

1.7 检测指标

心肌组织SOD、CAT及MDA含量的测定,采用分光光度法检测。心肌组织p-p38αMAPK、p38α MAPK、p-AKt及AKt蛋白的表达,用Western b lot检测,利用样本目的蛋白的光密度比内参照基因条带的光密度,对比不同样本的相对表达率。心肌组织TNF-α含量的变化,采用ELISA法测定。心肌组织caspase-8、caspase-3活性的表达,采用分光光度法检测。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0统计分析软件处理。计量资料数据以均数(BZ_139_2138_999_2156_1045)±标准差(s)表示,多组计量资料对比采用单因素方差分析,多组间两两对比采用LSD-t检验。以P＜0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

2.1 通心脉方对各组大鼠SOD、CAT及MDA的影响

与缺血再灌注组对比,正常灌流组、通心脉方大剂量组及卡维地洛组SOD、CAT含量升高,而MDA含量降低,差别有统计学意义(P＜0.01或 P＜0.05)。与正常灌流组对比,缺血再灌注组,通心脉方大、中、小剂量组及卡维地洛组SOD含量降低,差别有统计学意义(P＜0.01);缺血再灌注组,通心脉方中、小剂量组及卡维地洛组 CAT含量降低,差别有统计学意义(P＜0.01),而通心脉方大剂量组较之差别无统计学意义(P＞0.05);缺血再灌注组,通心脉方中、小剂量组MDA含量升高,差别有统计学意义(P＜0.01),而通心脉方大剂量组及卡维地洛组较之差别无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠心肌组织SOD、CAT及MDA水平的对比 ±s

表1 各组大鼠心肌组织SOD、CAT及MDA水平的对比 ±s

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注:与缺血再灌注组对比,*P＜0.05,**P＜0.01;与正常灌流组对比,##P＜0.01。

2.2 通心脉方对各组大鼠心肌组织p-p38αMAPK、p38αMAPK、p-AKt及AKt蛋白的影响

见图1-2。

图1 各组大鼠p-p38αMAPK、p38αMAPK、p-AKt及AKt蛋白表达

2.3 通心脉方对各组大鼠 p-p38αMAPK、p38αMAPK、p-AKt、AKt与GAPDH比较的相对表达水平对比

各组间p38αMAPK及AKt表达对比,差别无统计学意义(P＞0.05)。与缺血再灌注组对比,其余各组p-p38αMAPK蛋白表达减少,差别有统计学意义(P＜0.01),通心脉方大剂量组及卡维地洛组p-AKt蛋白表达增加,差别有统计学意义(P＜0.05)。与正常灌流组对比,缺血再灌注组及通心脉方小剂量组p-p38αMAPK蛋白表达明显增加,差别有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05),其余各组p-AKt蛋白表达增加,差别有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。见表2。

表2 各组大鼠p-p38αMAPK、p38αMAPK、p-AKt、AKt与GAPDH比较的相对表达水平对比 ±s

表2 各组大鼠p-p38αMAPK、p38αMAPK、p-AKt、AKt与GAPDH比较的相对表达水平对比 ±s

注:与缺血再灌注组对比,*P＜0.05,**P＜0.01;与正常灌流组对比,#P＜0.05,##P＜0.01。

组 别 动物数 p-p38αMAPK p38αMAPK p-AKt AK t缺血再灌注组 4 1.68±0.23## 0.87±0.27 0.99±0.18# 0.85±0.21正常灌流组 4 0.37±0.11** 0.86±0.08 0.54±0.20** 0.89±0.12通心脉方大剂量组 4 0.60±0.14** 0.82±0.21 1.44±0.32*## 0.79±0.16通心脉方中剂量组 4 0.62±0.14** 0.84±0.09 1.14±0.13## 0.87±0.10通心脉方小剂量组 4 1.05±0.15**## 0.78±0.08 0.81±0.05# 0.83±0.11卡维地洛组 4 0.62±0.04** 0.80±0.22 1.35±0.16*## 0.89±0.35

2.4 通心脉方对各组大鼠心肌组织TNF-α水平的影响

与缺血再灌注组对比,正常灌流组、通心脉方大剂量组及卡维地洛组TNF-α含量明显降低,差别有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 各组大鼠心肌组织TNF-α水平对比 ±s

表3 各组大鼠心肌组织TNF-α水平对比 ±s

注:与缺血再灌注组对比,*P＜0.05。

组 别 动物数 TNF-α/(μg·L-1)缺血再灌注组 8 473.62±151.88正常灌流组 8 222.47±71.51*通心脉方大剂量组 8 242.33±49.30*通心脉方中剂量组 8 339.35±101.17通心脉方小剂量组 8 401.38±114.87卡维地洛组 8 279.73±34.11*

2.5 通心脉方对各组大鼠心肌组织caspase-8及caspase-3活性的影响

以正常灌流组作为未诱导凋亡组,其余各组与正常灌流组比较数值作为caspase-8的活性。与缺血再灌注组对比,通心脉方大剂量组及卡维地洛组caspase-8及caspase-3活性明显降低,差别有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。见表4。

表4 各组大鼠心肌组织caspase-8及caspase-3活性对比±s

表4 各组大鼠心肌组织caspase-8及caspase-3活性对比±s

注:与缺血再灌注组对比,*P＜0.05,**P＜0.01。

组 别 动物数 caspase-8 caspase-3缺血再灌注组 8 2.74±0.48 2.96±0.81通心脉方大剂量组 8 1.14±0.23** 1.33±0.43*通心脉方中剂量组 8 2.32±0.73 3.04±1.23通心脉方小剂量组 8 3.20±0.52 3.92±1.17卡维地洛组 8 1.36±0.33** 1.07±0.23*

3 讨 论

心肌缺血再灌注中细胞凋亡现象首先见于1994年Gottlieb等[4]的报道。氧自由基(oxygen free radical,OFR)是一种终末损伤介质。大量资料表明,OFR产生过多和(或)清除能力下降在心肌缺血再灌注的机制中占有重要地位。缺血再灌注期间OFR可激活p38MAPK,且最大激活发生在再灌注10 min。p38αMAPK和p38βMAPK激活后效应相反,p38αMAPK加重心肌损伤,而p38βMAPK起保护心肌的作用[1]。TNF-α是一种主要的炎症细胞因子,能产生多种生理效应,在心肌缺血再灌注损伤的病理生理发展过程起到重要作用。心肌缺血再灌注时,TNF-α表达水平显著增加,伴有心功能的恶化和细胞凋亡[5]。凋亡启动亚类蛋白酶caspase-8是联系受体与胞浆执行分子的重要环节,当细胞膜表面的TNF-α与其配体TNFRI结合后,受体发生多聚化,通过自我催化生成活性形式的caspase-8蛋白酶,进而导致下游蛋白酶凋亡效应亚类caspase-3的激活,执行剪切细胞结构蛋白作用,直接使细胞发生凋亡[6]。

AKt在阻止细胞凋亡、调节糖代谢和蛋白合成等过程中均起着十分关键的作用。将离体大鼠心脏予以缺血预处理可显著增加AKt磷酸化,减少心肌梗死面积,予以PI-3K阻滞剂LY-294002可抑制缺血预处理介导的心肌保护作用[7]。

现代研究表明,通心脉方中的黄芪及川芎对大鼠心肌的保护可能与改善缺血再灌注冠状动脉微循环和清除氧自由基生成等机制有关[8-10]。本研究结果显示,心肌缺血再灌注后心肌组织中MDA及TNF-α大量生成,caspase-8及caspase-3活性显著升高,再灌注10 min明显激活p38αMAPK;通心脉方可显著升高心肌组织中SOD及CAT活性而降低MDA及TNF-α含量,同时使caspase-8及caspase-3活性明显降低。结果提示,通心脉方减轻心肌缺血再灌注损伤及细胞凋亡的机制可能与减轻缺血再灌注后心肌细胞脂质过氧化反应,抑制p38αMAPK的活性,减少 TNF-α的翻译和合成,阻断受体依赖性死亡级联反应以及同时激活细胞增殖信号AKt有关。

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