城市生活垃圾除臭酵母的筛选与鉴定

许丽娟，魏小武，孙翔宇，陈 薇，贺月林

(湖南省微生物研究所，湖南长沙 410009)

城市生活垃圾治理是目前我国城市面临的最严重的环境问题之一。我国城市生活垃圾年清运量约为1.5亿t，除少部分焚烧、堆肥或回收利用外，绝大部分被运送到填埋场进行处置。这些城市固体废弃物在转运、堆放处理过程中产生大量臭气［1］。恶臭气体不仅污染空气，对生态环境造成影响，还会导致人、畜疾病的传播，影响居民的正常生活和身体健康［2］。笔者通过对城市生活垃圾除臭酵母的筛选及鉴定，获得无害、高效的除臭酵母菌株。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

试验菌种是从城市生活垃圾中分离、纯化出来的具有一定除臭效果的酵母菌，从中优选出3株，分别为 J1、J2、J3。生活垃圾取自浏阳垃圾填埋场。

1.2 培养基

分离纯化用麦芽汁培养基［3］，培养用PDA培养基［4］。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株的初筛

按10%接种量接入所试菌株于发臭垃圾中，以自来水作为对照，分别于接种后24h、48h、72h使用便携式氨气检测仪NBX80－NH3检测，初步判断各菌株的除臭效果，对经便携式检测仪测定有除臭能力的微生物进行复筛实验。

1.3.2 菌株的复筛

取18ml菌液于2L大烧杯中，加入500mg/L的氨水2ml;再往大烧杯中放入装有20ml 0.005N硫酸吸收液的50ml小烧杯，大烧杯盖上双层塑料薄膜密封。以等量的无菌水作为对照，每个处理重复3次，置于30℃的培养箱中培养。24h后，取出小烧杯检测氨的浓度。氨的测定采用纳氏试剂比色法［5］。

1.3.3 酵母菌的鉴定

对筛选出的脱氨作用最强的菌株，通过形态学观察并结合一些生理学试验来进行鉴定。

1.3.3.1 菌落和菌体形态学观察

将新培养的酵母接于PDA平板上，置于30℃恒温培养箱中培养3d，观察菌落形态;用接种环以无菌操作法挑取菌落少许，制成水浸片，用显微镜观察细胞形态。

1.3.3.2 菌的生理生化特性

糖类发酵试验［6］。往试管内注入12.5%的豆芽汁3.2ml，并于每支试管内放入一倒置的杜氏小管，试管口包扎好后，115℃灭菌20min备用。分别于上述每支试管内加入10%葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和半乳糖糖液0.8ml，静置2h，使杜氏管内外的糖液均匀扩散。将J3菌分别接种于含糖试管中，置30℃恒温箱内培养3d后观察，杜氏管内有气泡存在则说明J3菌可发酵该种糖类。

硝酸盐利用试验［7］。①将测试酵母菌进行饥饿培养。把活化好的菌株接种在4ml无菌碳源基础培养基中，25℃培养5～7d，以消耗细胞内多余的氮源，防止出现假阳性结果。②制备碳源基础平板培养基。取11.7g酵母碳源基础培养基，20g纯化琼脂粉，加1000ml蒸馏水，加热将琼脂粉熔化后经115℃灭菌30min，冷却至大约45℃时倒入预先已加入1ml饥饿培养后的酵母细胞悬液的平板中，混匀后静置，凝固后放在25℃培养箱内数小时，使平板表面干燥，然后把少量所测氮源化合物点在平板上。点置试剂后的平板在25℃下培养2～3d，观察结果，阳性反应者在所点试剂处或周围有酵母菌落生长。

产生类淀粉化合物试验［6］。将菌株J3划线接于PDA固体培养基中，置于28℃温箱内培养，待长好后，向平板上倾入卢哥氏 (Lugo1)碘液，若酵母菌落周围呈现蓝色，则为阳性。

产酸试验［6］。在含碳酸钙的PDA斜面上接种酵母菌，置于30℃恒温箱中培养10d后观察，能产酸的酵母菌能使碳酸溶解而导致培养基呈现透明。

尿酶试验［8］。取新培养的酵母菌，接种于作水解尿素试验的琼脂斜面上，28℃培养。5～7d后，如琼脂斜面上呈淡红色，则此酵母能分解尿素。

2 结果与分析

2.1 初筛实验

对分离出的数株菌株进行了初步的降氨实验，结果发现有3株菌株表现出较好的除臭作用。且根据感观判断，J3菌株除臭能力最强，J2菌株略优于J1菌株，但初筛实验只是一个简单的定性实验，还需要作进一步的定量实验以判断各菌株除臭能力的强弱。

2.2 复筛实验

将初筛试验中有除臭作用的3株菌株做进一步的复筛实验，以确定各菌株降氨能力的大小，复筛实验结果见图1。实验结果表明，24h内，J1、J2、J3的脱氨率分别为65%、60%、85%，其中J3对氨的去除率最高，除臭效果也最稳定。复筛实验结果与初筛实验基本相符，但不难看出初筛实验也存在一定的局限性，在初筛实验中J2的除臭效果要优于J1，但复筛实验正好相反，因此，只有将初筛与复筛方法相结合才能获得高效脱臭菌株。

2.3 菌株的形态学观察

对J3菌株的菌落及菌体形态进行了观察。从图2、图3可见，在PDA固体培养基上J3菌株菌落圆形，湿润光滑，中间凸起，边缘整齐，易挑起，颜色乳白色;光学显微镜下可见细胞椭圆形，细胞的生殖方式为芽殖。

图2 J3菌株的菌落特征

图3 J3菌株的菌体形态

2.4 生化试验

在形态学分析的基础上，对该菌株进行了进一步的生理生化实验，实验结果如表1所示。结果表明，J3菌株糖类发酵、硝酸盐试验、产类淀粉试验及产酸试验均呈阴性，尿酶试验呈阳性，按J·Lodder(1970)酵母分类学鉴定的方法进行酵母的分类，将其归为掷孢酵母。

表1 J3菌株的生理生化结果

3 结论

城市生活垃圾在转运、堆放处理过程中产生大量臭气，造成严重的环境污染。臭气中对人畜健康影响最大的有害气体主要是氨气和硫化氢。本试验以氨的释放量作为判定菌株除臭能力的一个指标，采用初筛与复筛相结合的方法，从垃圾中分离筛选出了一株能明显降低氨气释放量的J3菌株，其对氨的去除率达80%以上。通过对J3菌株的菌落特征及菌体形态学观察，结合菌株的生理生化实验，初步确定J3菌株为掷孢酵母 (Sporobolomyces roseus)。

［1］石磊，边炳鑫，赵由才，等.城市生活垃圾卫生填埋场恶臭的防治技术进展 ［J］.环境污染治理技术与设备，2005，6(2).

［2］单奇华，俞元春，傅利剑，等.除臭酵母的筛选及其除臭机理［J］.南京林业大学学报，2005，29(4).

［3］沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验 (第3版) ［M］.北京:高等教育出版社，1999.

［4］胡开辉.微生物学实验［M］.北京:中国林业出版社，2004.

［5］吴小平，郑耀通.除臭微生物的筛选［J］.福建轻纺，2002，(1).

［6］陈彬，鲁绯，王夫杰，等.酱油增香发酵用耐盐酵母菌的生理生化特性分析及菌种鉴定 ［J］.中国酿造，2010，(11).

［7］徐军，罗惠波，崔德宝，等.大曲中酵母菌的分离及其鉴定［J］.酿酒，2008，35(3).

［8］ 赵斌，何绍江.微生物学实验 ［M］.北京:科学出版社，2002.