叶酸和维生素B12对糖尿病肾病患者氧化应激水平的影响

罗惠辛 郭沛艳 宋淑萍 窦若兰 胡若梅 王 娟 张向英

糖尿病肾病（DN）是糖尿病常见的微血管并发症之一，也是终末期肾病的主要病因。研究显示高同型半胱氨酸（Hcy）血症是心血管疾病的独立危险因素[1]，但与糖尿病尤其是DN的关系研究尚少，结论也不一致，与其相应的干预措施更少，而其致病机制亦尚未完全阐明。本研究旨在通过观察维生素B12、叶酸对DN患者血浆Hcy水平和氧化应激的影响，以期为DN提供有效的防治方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料 根据1999年WHO诊断标准，选择2006年7月—2008年7月在我院内分泌科住院的2型糖尿病患者，且24 h尿白蛋白排泄0.3～1.0 g，排除其他疾病，如急慢性肾炎、充血性心力衰竭、发热和泌尿系感染等引起的蛋白尿和肾功能不全，选择DN患者共40例。用随机数字表法将患者随机分为2组，即DN1、DN2，每组20例。DN1为非干预组，给予控制血糖及相应对症治疗；DN2为干预组，在控制血糖及相应对症治疗的基础上给予叶酸（FA）5 mg+维生素B12[VitB12，选用卫材（中国）药业有限公司甲钴胺]500 μg口服，每日3次，干预时间为2周。

1.2 标本采集和检测方法

1.2.1 标本采集 给药前后分别过夜空腹12 h，清晨取外周静脉血13 mL，其中5 mL用于检测生化指标；3 mL于1 h内送到免疫室测定Hcy、FA、VitB12水平；5 mL于2 h内3 000 r/min离心20 min，吸取上清0.8～1.0 mL，编号后冻存于-20℃冰箱，用于血清丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、一氧化氮（NO）的测定。同时监测患者的收缩压（SBP）和舒张压（DBP）。

1.2.2 检测方法 空腹血糖（FPG）、餐后2 h血糖（2 hPG）、血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、肝功能、总胆固醇（CHO）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）等均由全自动生化分析仪测定。糖化血红蛋白（HbA1c）、24 h尿微量白蛋白由NycocardreaderⅡ仪器通过干化学法测定。Hcy测定采用荧光偏振免疫分析法。FA、VitB12使用gama计数仪采用双标记放免法。MDA测定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。SOD活力测定采用黄嘌呤氧化酶法。NO浓度测定采用硝酸还原酶法。

1.3 统计学方法 应用SPSS 11.5软件进行统计分析。计量资料以±s或M（P25，P75）表示。所有资料均进行正态性和方差齐性检验，非正态分布或方差不齐者，进行对数转换后进行分析，组间比较采用t检验，干预措施前后比较采用配对t检验；计数资料比较用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组一般资料及相关指标比较 2组DN患者干预前年龄、SBP、DBP、BUN、Cr、HbA1c、CHO、TG、LDL-C、HDL-C、病程等差异均无统计学意义（均P＞0.05），具有可比性，见表1。2组FPG、2 hPG、FA、VitB12、Hcy、NO、MDA、SOD、24 h尿微量白蛋白等治疗前比较差异无统计学意义，见表2。

2.2 2组患者干预前后FPG、2 hPG、Hcy、VitB12、FA、NO、MDA、SOD改变 干预2周后，DN1组FA、 VitB12、Hcy无明显变化，而FPG、2 hPG、MDA及24 h尿微量的蛋白较干预前下降，NO、SOD较干预前升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。DN2组治疗后患者的血清FA与VitB12水平均上升，Hcy水平下降，同DN1组相似FPG、2 hPG、MDA及24 h尿微量白蛋白较干预前下降，NO、SOD较干预前升高，差异具有统计学意义（P＜0.01），见表2。

2.3 2组FPG、2 hPG、NO、MDA、SOD、24 h尿微量白蛋白变化的比较 2组FPG、2 hPG干预前后的差值无明显差异（P＞0.05），而DN2组NO、SOD上升幅度明显大于DN1组，同时DN2组MDA及24 h尿微量白蛋白的下降幅度明显大于DN1组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

3 讨论

Hcy在细胞内代谢处于再甲基化和转硫化作用的交叉点，把FA、VitB6、VitB12相联系起来。FA、VitB6、VitB12等维生素缺乏（营养因素）和Hcy代谢过程中的一些酶的基因突变（遗传因素），均可导致血中Hcy的升高。补充FA、VitB6、VitB12是目前防治高同型半胱氨酸血症的最常用、最经济和最有效的方法[2]，本研究结果表明口服FA+VitB12可降低DN患者血清Hcy。

表12 组DN患者一般资料和相关指标比较 （n=20）

轻中度高同型半胱氨酸血症可引起动脉粥样硬化、心肌梗死、脑血管病、外周血管病等多种疾病，是血管性疾病的独立危险因子[3]。Hcy诱导的氧化应激被认为是其损伤心血管功能的最重要机制之一。Hcy可以促进血管内皮细胞的氧化损伤，特别是通过Hcy的自身氧化、Hcy二硫化物的形成、同型半胱氨酸硫内酯的形成以及蛋白质的同型半胱氨酸化。Hcy与糖尿病大血管病变的关系已较明确，研究显示Hcy水平与糖尿病微血管并发症密切相关，高Hcy血症可能参与了糖尿病微血管并发症的发生和发展[4]。自Nakagawa等[5]发现NO合酶基因敲除的糖尿病小鼠更易形成典型的DN以来，NO在DN中的保护作用已经明确，但日本一项研究显示，在微量白蛋白尿阶段的2型糖尿病患者与非糖尿病患者相比，其肾小球内皮细胞中NO合酶的表达增加[6]。Apakkan等[7]发现在早期肾小球体积增大、肾小球滤过率增加时，血、尿NO水平增加、血MDA水平增加，他们认为NO水平升高可能会引起肾小球的高滤过和高灌注，引起尿微量白蛋白的排泄率增加，导致2型糖尿病患者早期肾脏疾病的进展。笔者的研究表明2周后DN1和DN2 2组FBG、2 hPG、MDA、24 h尿微量白蛋白较干预前下降，NO、SOD较干预前升高。2组干预前后差值比较表明，2组FBG、2 hPG降低程度没有明显差别，但是DN2组MDA下降的幅度明显大于DN1组，DN2组NO、SOD升高的程度亦明显高于DN1组，同时DN2组24 h尿微量白蛋白干预前后的差值明显高于DN1组。结合干预前后Hcy的变化，笔者认为口服FA+VitB12可通过降低Hcy，进一步降低DN患者体内的氧化应激水平，并减少24 h尿微量白蛋白。本研究NO检测结果与Apakkan等[7]报道相反，可能与NO合酶有关，而NO合酶存在3种亚型，在Hcy作用的不同时期NO合酶活性表现并不一致。在DN的发展中，NO的合成经历了合成减少、活性增加、活性降低3个阶段。在DN早期寻求相关的NO拮抗剂，晚期努力保持NO活性在合理水平，可能是治疗DN的有效措施。

表2 2组DN患者干预前后相关指标比较 （n=20，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；t1为配对前后比较结果，t2为2组干预前及变化差值比较结果

组别DN1 DN2 FPG（mmol/L） 2 hPG（mmol/L） FA（nmol/L）t1t1干预后6.32±0.88 6.32±0.64差值2.68±2.00 3.27±2.29 0.860干预前9.00±2.33 9.59±2.57 0.756 t1 5.991＊＊6.373＊＊干预后8.55±1.85 8.30±1.77差值5.66±3.30 5.76±3.71 0.095干预前14.20±4.79 14.06±4.40 0.096 7.657＊＊6.940＊＊干预后5.85±2.15 14.77±3.1 1.112 21.499＊＊干预前5.70±1.93 5.72±2.55 0.028 t2 组别VitB12（pmol/L） Hcy（μmol/L） NO（μmol/L）DN1 DN2 1.853 10.722＊＊干预前401.81±125.98 389.24±144.87 0.293干预后405.60±122.17 714.03±156.93 t1 t1 t1干预前25.63±2.49 25.04±2.75 0.709干预后25.46±2.58 14.85±1.48 1.989 18.181＊＊干预前63.05±11.77 66.03±15.53 0.684干预后106.28±26.10 132.34±39.05 7.434＊＊7.483＊＊t2差值43.24±26.01 66.31±39.63 2.177＊MDA（μmol/L） SOD（U/mL） 24 h尿微量白蛋白（g）组别t1 t1 t1 DN1 DN2干预后5.35±13.62 4.19±1.09 11.014＊＊14.629＊＊干预后84.03±15.80 96.31±18.47 12.365＊＊11.248＊＊干预后0.40±0.31 0.27±0.24 7.825＊＊6.699＊＊t2干预前7.95±1.51 7.62±1.32 0.751差值2.60±1.06 3.43±1.05 2.480＊干预前56.19±17.69 59.45±19.71 0.550差值27.83±10.07 36.87±14.66 2.272＊干预前0.73±0.33 0.80±0.55 0.476差值0.33±0.19 0.53±0.39 1.434＊

目前虽然FA和VitB12对临床降低和消除高同型半胱氨酸血症是有效的，但有关降低Hcy对糖尿病慢性并发症影响的长期、大规模临床研究少见。补充维生素后的远期效果如何，停药后有无反复及能否预防由高同型半胱氨酸血症引起的氧化应激水平增强，尚需更大规模前瞻性的研究进一步论证。

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