O型口蹄疫病毒VP1基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立*

王云龙,孙 强,昌静峰,李玉林,王国强,董彩文,刘旺根,梁晓艳,孙新城

(1.河南师范大学生命科学学院,河南新乡453007;2.郑州职业技术学院,河南郑州450121;3.河南省生物工程技术研究中心,河南郑州450001)

近年来,许多动物传染病的暴发给畜牧业带来巨大冲击,其中口蹄疫(Foot-and-mouth disease,FMD)因其发生的广泛性和严重破坏性而被人们高度关注。根据世界动物卫生组织(Office international des epizooties,OIE)规定,一旦暴发FMD,所有感染和接触的动物都必需宰杀并销毁尸体。目前,除大洋洲和北美洲,FMDV已侵袭过所有大陆[1]。FMD的病原为口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)。该病毒为小RNA病毒,病毒粒子包括衣壳和RNA两部分。衣壳(VP)由VP1、VP2、VP3、VP4四类蛋白组成,它们又各由60个分子组成[2]。现已证明,对于O型口蹄疫,有3个中和性抗原位点在VP1上,位于21～40、141～160、200～213位氨基酸,其中141位～160位及200位～213位氨基酸为B细胞表位,引发体液免疫反应[3]。从病毒衣壳蛋白分离的VP1可诱导动物产生针对该表位的中和性抗体[4]。因此,人们已经开始尝试利用衣壳蛋白上的抗原表位设计重组基因工程抗原以检测和预防FMD[5]。

基于VP1基因对FMDV的重要意义,本研究以河南省生物工程技术研究中心提供的质粒T234/FMDV为模板,扩增出结构蛋白VP1基因,应用原核表达载体pET-41b,以重组蛋白的形式对VP1基因进行表达,并对表达的重组蛋白抗原性进行了检测,为进一步研制FMDV VP1诊断试剂盒和基因工程疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及引物

1.1.1 菌株、质粒、抗体和血清 克隆菌TG1、表达菌BL21(DE3),质粒T234/FMDV,表达载体pET-41b,HRP标记的兔抗猪抗体,猪FMDV阳性血清,猪FMDV阴性血清,猪圆环病毒(Porcine circo virus,PCV)阳性血清,猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)阳性血清,猪细小病毒(Porcine parvoviurs,PPV)阳性血清,由河南省生物工程技术研究中心提供。

1.1.2 主要试剂 限制性内切酶,Taq DNA聚合酶,T4DNA连接酶,无DNA酶的胰RNA酶,宝生物工程(大连)有限公司产品;pfu DNA聚合酶,天为时代公司产品;DNA回收试剂盒,QIA Gen-Sciences公司产品。

1.1.3 引物 引物由上海博尚生物技术服务有限公司合成

1.2 方法

1.2.1 目的基因的扩增 以携带有VP1基因的T234/FMDV为模板,扩增条件为94℃预变性5 min;94℃50 s,58℃50 s,72℃50 s,30个循环;72℃5 min。按照DNA回收试剂盒说明书(QIA Gen Sciences)回收PCR产物。

1.2.2 表达载体的构建与鉴定 用限制性内切酶Bam HⅠ、HindⅢ分别酶切PCR产物和质粒pET-41b。按DNA胶回收试剂盒说明操作回收PCR产物和线性化载体片段,T4连接酶16℃连接过夜。连接产物转入TG1中,涂布LB平板(卡那霉素30 mg/L),37℃过夜培养。筛选阳性菌落,摇菌,碱裂减法提取质粒,BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定。质粒转入BL21(DE3)中,LB平板(卡那霉素30 mg/L)筛选阳性菌株,寄送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。菌种按1∶1的比例加入到灭菌的150 mL/L的甘油中,置—80℃保存。

1.2.3 目的蛋白的诱导表达 重组菌在37℃、200 r/min培养至OD600为0.6～0.7时,加IPTG至终浓度为0.1 mmol/L,37℃诱导5 h。诱导结束后取出,冰浴10 min,收集菌体,0.02 mol/L pH 7.8 PBS洗涤,pH 7.8 PBS重悬,超声破碎后,12 000 r/min离心2 min,收集上清和沉淀,进行SDS-PAGE分析。用BL21(DE3)空菌作为阴性对照。

1.2.4 Western blot检测表达产物免疫活性 按照Sambrook方法进行Western blot[6]。一抗使用猪抗FMDV阳性血清,二抗使用H RP标记的兔抗猪抗体,鉴定活性。

1.2.5 目的蛋白的纯化及复性 取重组菌株大量发酵,诱导条件同1.2.3。5 000 r/m离心10 min,弃上清,10mL/LTritonX-100洗涤沉淀。5 000 r/m离心10 min,弃上清,0.02 mol/L pH 7.8 PBS重悬,8 mol/L尿素溶解,过镍亲和层析柱,依次用含20、50、100、200 mmol/L咪唑的缓冲液梯度洗脱,SDS-PAGE电泳检测洗脱液,凝胶薄层扫描软件分析蛋白纯度。纯度较高的蛋白质溶液按文献[7]的方法复性。

1.2.6 间接ELISA检测方法的建立 用方阵滴定法,以不同浓度的表达蛋白作为包被抗原,4℃包被过夜,洗涤后用10 g/L BSA在37℃封闭2 h。用样品稀释液1∶10开始倍比稀释猪O型口蹄疫阳性血清,猪O型口蹄疫阴性血清1∶10稀释作为阴性对照,按ELISA步骤进行操作,以阳性血清的OD450值接近1,P/N值最大时的抗原浓度为最佳包被抗原浓度,对应的血清稀释倍数为最佳血清稀释度[8]。

1.2.7 酶结合物最佳稀释度 HRP标记的兔抗猪抗体按1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000、1∶12 000的比例稀释,每个稀释度加2孔,以阳性血清的OD450值接近l,P/N值最大时所对应的浓度为酶结合物最佳工作浓度。

1.2.8 间接ELISA阴性阳性临界值判定 取20份O型口蹄疫阴性血清,80倍稀释作为待检血清,测OD450值后计算平均值和标准差,以X_±2S为阴性、阳性血清的临界值,OD450值大于此临界值的为阳性。

1.2.9 间接ELISA的特异性的检测 分别检测FMDV阳性血清、FMDV阴性血清、PCV阳性血清、CSFV阳性血清、PPV阳性血清,鉴定ELISA检测方法的特异性。

2 结果

2.1 PCR扩增产物的鉴定

PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳,可见一条约640 bp左右的条带,与预期相符(图1)。

图1 VP1基因片段的PCR扩增结果Fig.1 PCR Amplication of VP1 gene

2.2 重组质粒的鉴定

提取质粒后酶切鉴定,结果显示切出的片段大小与预期相符(图2)。测序结果与GenBank(登录号:GQ292738.2)上公布的序列进行比对,同源性达98%。

图2 重组质粒pET-41b/VP1酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pET-41b/VP1 by enzy me digestion

2.3 目的蛋白的诱导表达

BL21(DE3)/pET-41b/VP1在37℃,0.1 mmol/L IPTG诱导条件下以包涵体形式表达,SDS-PAGE显示目的蛋白分子质量在58 ku左右(图3)。

图3 SDS-PAGE分析BL21(DE3)/pET-41b/VP1的表达Fig.3 Expression of BL21(DE3)/pET-41b/VP1 analyzed by SDSPAGE

2.4 Western blot检测结果

表达产物经SDS-PAGE电泳、Western blot检测,结果显示沉淀液处出现1条特异性条带(图4),说明所表达的重组蛋白能被口蹄疫阳性血清所识别,表明纯化的重组蛋白具有与相应天然蛋白相同的抗原性。

图4 表达产物的免疫印迹分析Fig.4 Analysis of the ex pressed fusion protein by Western blot

2.5 表达产物纯化及SDS-PAGE电泳分析

采用镍亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化。从SDS-PAGE电泳结果可以清晰地看出在分子质量约58 ku处有明显的目的蛋白条带。经过50 mmol/L咪唑洗脱收集的蛋白经薄层层析扫描,其纯度可达97.7%,但浓度较低(图5)。

图5 SDS-PAGE分析表达产物的纯化结果Fig.5 Purification of VP1 analyzed by SDS-PAGE

2.6 间接ELISA检测方法的初步建立

随着VP1蛋白抗原包被量的减少和血清稀释倍数的增大,测得的OD值不断减小;当VP1蛋白抗原包被量为1 mg/L,血清稀释倍数为80倍时,FMDV阳性血清的OD450值在1.0左右,P/N值达到20.71(阴性对照值为0.048)。因此,ELISA方阵确定的最佳抗原包被量为1 mg/L,血清稀释倍数为80倍。

2.7 酶结合物的最佳稀释度

酶结合物的稀释度为1∶8 000时,OD值接近1,P/N值最大,将其定为酶结合物的最佳稀释度(表1)。

2.8 间接ELISA检测临界值判定

20份口蹄疫阴性血清,80倍稀释后作为待检血清,测OD450值后计算平均值和标准差,_X±2S值为0.042,S值为0.011,则临界值_X±2S为0.064(表2)。

2.9 间接ELISA的特异性的检测

猪抗FMDV阳性血清检测为阳性,其余的样品检测为阴性(表3)。

表1 方阵试验确定抗原包被浓度和抗体工作稀释度T able 1 Selection of ideal antigen coating concentration and antiserum dilution

表2 酶结合物最佳稀释度的筛选T able 2 Screening of optimal dilution of peroxidase

表3 特异性试验结果Table 3 The results of specificity test

3 讨论

目前,针对FMDV的检测方法主要是间接血凝和全病毒的ELISA方法,然而这两种方法都是建立在全病毒的基础上的,存在着一定的安全隐患[9-10]。由于经过纯化、复性的VPl蛋白与其抗血清结合能力强,因此可将经过纯化、复性的VPl蛋白作为包被抗原,开发口蹄疫病毒VPl结构蛋白抗体间接ELISA诊断试剂盒,检测易感动物抗体水平[11]。ELISA的非特异性是许多研究者都遇到过的共同的问题,影响的因素也较多。采用高纯度的抗原抗体是降低非特异性反应的关键性因素。利用基因工程克隆和表达FMDV VP1编码基因的报道很多,有的用大肠埃希菌、酵母、杆状病毒或痘病毒表达,也有的用哺乳动物细胞甚至植物表达系统生产FMDV部分结构蛋白、全部结构蛋白和空衣壳[12],但在这些方法中提高表达量或进行表达产物的纯化是难点。本试验利用原核表达系统诱导表达了VP1重组蛋白,结果表明VP1在E.coli中得到了高效表达,经37℃,0.1 mmol/L IPTG诱导表达,表达蛋白为包涵体,变性、纯化和复性处理后,目的蛋白的纯度可达90%以上。由于只有当包被的抗原同感染动物的FMDV中的相应抗原在结构上完全一致时,才会有抗原抗体结合反应发生[13],故Western blot检测结果肯定了我们所纯化的重组蛋白具有抗原性。

综上所述,利用原核表达系统诱导表达了VP1重组蛋白,通过镍亲和层析法对这一蛋白进行了纯化。收获的目的蛋白纯度高、活性良好。本研究对间接ELISA条件的摸索和O型口蹄疫诊断试剂盒的研制奠定基础。

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