聚天冬氨酸修饰玻碳电极伏安法检测阿魏酸

王晓岗,王 瑶,樊雅娟,李 静

(1.同济大学 化学系,上海200092;2.盐城市第三人民医院 神经内科,江苏盐城 224000; 3.同济大学数学系,上海 200092)

阿魏酸(4-羟基-3-甲氧基肉桂酸,FA)是当归、升麻、蜂胶、川芎等中草药材的有效成分之一,它具有抑止血小板聚集、促进血小板解聚、抗血栓形成、抗氧化、抗菌、消炎、镇痛、利肝保湿等药理功能[1],被广泛应用于食品、制药、化妆品等行业[2]. FA含量的检测方法主要有高效液相色谱法[3]、薄层色谱法[4]、毛细管电泳法[5]、光谱法[6]和电化学方法[7].其中,色谱和光谱法通常需要对样品进行前期预处理,操作时间长,仪器费用高.比较而言,电化学方法则具有快速、方便、成本低、在水溶液中不必前处理直接进行检测的特点.目前已有玻碳(GC)电极[7]、L-半胱氨酸自组装修饰金电极[8]和碳纳米管修饰电极[9]被成功用于FA的电化学检测,但有关文献数量很少.本文介绍了一种新型氨基酸修饰电极,在水溶液中通过电聚合方式直接将天冬氨酸(aspartic acid)修饰到玻碳(GC)电极表面,这种新型电极用于检测FA时具有电极制备简单、方便,测定的线性范围宽,检出限低等特点.将此电极用于实际样品逍遥丸中FA的检测,获得了令人满意的结果.

1 实验部分

1.1 试剂

FA和DL-天冬氨酸购买于上海化学试剂公司,所有试剂均为分析纯.溶液用二次蒸馏水配置.修饰液将DL-天冬氨酸(1.0×10-3mol◦L-1)溶解在pH为6.84,0.01 mol◦L-1的磷酸盐缓冲液(PBS)中配制而得.

1.2 仪器

电化学实验在CHI-660B电化学工作站上进行(上海,辰华公司),采用三电极体系,参比电极为饱和甘汞电极(SCE),对电极为铂丝电极,工作电极为直径3 mm的GC电极或修饰电极.

1.3 修饰电极的制备

修饰前GC电极依次用0.10,0.05 μ m氧化铝粉末打磨,再在浓硝酸、二次蒸馏水、无水乙醇中超声以除去氧化铝粒子.打磨后的GC电极浸在1.0× 10-3mol◦L-1天冬氨酸修饰液中采用循环伏安(CV)技术进行电聚合,电位范围-1.0～1.5 V,扫描速度100 mV◦s-1.扫描15周后,取出电极用二次蒸馏水清洗,再在pH为6.84,0.01 mol◦L-1PBS缓冲溶液中超声5 min以去除电极表面吸附的、未反应的物质.电极在空气中晾干即得聚天冬氨酸(poly -Asp/GC)修饰电极.

1.4 测量步骤

以0.1 mol◦L-1,pH为4.5 HAc-NaAc缓冲液为底液.测定前,修饰电极在底液中循环扫描数周至稳定,样品溶液通氮气除氧;测定时,电极置于样品溶液中搅拌开路富集3 min,静止2 s.实验采用循环伏安(CV)和微分脉冲(DPV)技术,扫描范围0～ 0.85 V.DPV技术的参数选择:电位递增0.004 V,振幅0.05 V,脉冲宽度0.05 s,脉冲周期0.2 s.每次测定后,修饰电极在空白底液(0.1 mol◦L-1HAc -NaAc)中循环扫描10周进行清洗,所有实验均在室温下进行.

2 结果讨论

2.1 FA在poly-Asp/GC修饰电极上的电化学行为和机理分析

在以前的报道中,聚天冬氨酸修饰电极的制备均在有机相中进行,通常在含有NBu4BF4的乙腈溶液中实现天冬氨酸的电聚合[10-11].本文采用的修饰方法有所不同,电聚合过程直接在PBS水溶液中进行,制备方法更为简便、快速.图1为GC电极在1.0×10-3mol◦L-1DL-天冬氨酸修饰液中的CV曲线.可以看出,正向扫描时CV曲线上出现一个氧化峰,对应峰电位为1.037 V;反向扫描时出现一个还原峰,峰电位为-0.577 V.随着扫描周数的增加,氧化峰电流和还原峰电流都有所增强,这说明天冬氨酸在GC电极表面上发生了聚合,形成了导电性能良好的聚合膜.

图1 天冬氨酸在GC电极上的CV曲线Fig.1 CV curves of aspartic acid at GC electrode

图2为FA(7.5×10-5mol◦L-1)在GC电极(曲线1)和poly-Asp/GC修饰电极上(曲线3)的CV曲线,曲线2,4为两电极在空白溶液中的CV曲线.可以看出,GC电极和修饰电极均表现出微小的背景电流.曲线1显示:FA具有两个氧化峰和一个还原峰,峰电位分别为0.516 V(A)、0.609 V(B)和 0.220 V(C).氧化峰A和还原峰C之间的电位差达0.296 V.与曲线1相比,FA在poly-Asp/GC电极上的电信号明显增强,峰电流A由1.65 μ A变为4.71 μ A,增加了3倍.与此同时,氧化峰A和还原峰C电位间距由原来的0.296 V减小到0.218 V,电化学反应的可逆性得到改善.

图2 FA在GC电极和poly-Asp/GC修饰电极上的CV曲线Fig.2 CV curves of FA at the GC and poly-Asp/GC modified electrode

据报道,poly-Asp/GC修饰电极可以改善多巴胺[10]、对苯二酚和邻苯二酚[12]的电化学反应动力学过程,但用于检测FA的研究尚未见报道.由图2可知,FA在修饰电极上的氧化还原电流同步上升,但峰形变化不大,二者的作用表现出明显的表面吸附特征,据此,可以推测作用机理如下:DL-天冬氨酸经电聚合氧化产生了相应的阳离子自由基,自由基中的N原子和GC电极上的C原子通过共价结合,在GC电极表面形成了聚合物薄膜[10,13].聚合膜中的天冬氨酸含有大量的羟基和羧基,这些基团极易和FA分子中的羟基形成氢键,故而聚合膜对FA表现出良好的吸附能力,有效地增加了FA在电极表面吸附的浓度,与此同时,氢键的形成可以降低FA分子中苯环上O—H键的键能,羟基变得更易被氧化[14].基于以上原因,FA在poly-Asp/GC修饰电极上的电流响应得到显著提高.

图3为FA(7.5×10-5mol◦L-1)在GC电极(曲线1)和poly-Asp/GC修饰电极(曲线2)上的DPV曲线.与图2相比,图3中的第一个氧化峰变得更加尖锐,这意味着DPV技术在检测FA时比CV技术具有更高的灵敏度.因此,本文在下面实验中将采用DPV技术,通过测量氧化峰A来实现FA的定量检测.

图3 FA在GC和poly-Asp/GC修饰电极的DPV曲线Fig.3 DPV curves of FA at the GC and poly-Asp/GC modified electrode

2.2 实验条件的优化

2.2.1 循环伏安扫描次数的影响

聚天冬氨酸聚合膜的厚度可以通过电聚合过程中循环伏安扫描的次数来控制.在研究聚合膜厚度对FA电流影响时发现:刚开始随着循环次数的增加,FA的氧化峰电流明显增加,伏安扫描循环10周之后,氧化峰电流增加缓慢,当循环次数增加到20周时,电流峰值逐渐降低.这一现象解释如下:刚开始随着天冬氨酸聚合膜的形成,FA在电极表面的吸附浓度不断增加,氧化还原电流也随之上升,当吸附达到饱和后,再增加聚合膜的厚度,由于电极表面反应活性点数量减少导致电流下降.本文选择扫描15周来制备修饰膜.

2.2.2 pH的影响

实验采用NaOH来调节溶液的pH值.研究发现,FA的氧化峰电位随pH增加而负移.在pH为 3.0～6.0范围内,峰电位与pH值呈线性关系,线性方程为E(V)=0.697 6-0.046 38pH,相关系数R= 0.995,表明FA的电化学氧化有质子参与,且参与质子数和传递的电子数相同.图4为氧化峰电流与pH之间的关系,可以看出,在pH为3.5～5.0范围内电流值较大.本文选择实测pH为4.5.

图4 pH对FA的氧化峰电流的影响Fig.4 The influence of pH on the oxidation peak current of FA

2.2.3 扫描速度的影响

室温下,测定FA溶液(7.5×10-5mol◦L-1)在不同扫描速度v下的CV曲线.在 v=10～100 mV◦s-1范围内,FA的氧化峰(A)电流与扫描速度呈线性关系,回归方程为:I=0.066 7v+0.919,相关系数R=0.995.根据Laviron理论可以推测FA的电氧化反应是吸附控制过程[15].

2.3 标准曲线

在优化条件下,采用DPV技术测定FA的氧化峰电流和浓度C(10-5mol◦L-1)的关系,见图6.在浓度为9.1×10-7～3.0×10-3mol◦L-1范围内, FA的氧化峰电流与其浓度呈线性关系,回归方程为I=0.378 7C+2.835,相关系数R=0.998.

图5 FA的标准曲线Fig.5 The calibration of FA

2.4 干扰实验

干扰实验中,K+,Cu2+,Al3+,Ca2+,Mg2+, Fe2+,NH+4,NO-3,Cl-,SO2-4(浓度1.0×10-2mol◦L-1)和L-苯丙氨酸,色氨酸,酪氨酸,精氨酸,丝氨酸,葡萄糖,甘氨酸,乳糖,尿素(10倍浓度)对FA的检测都没有影响,误差小于5%.但高浓度的抗坏血酸会干扰FA的测定.

2.5 重现性和检测限

poly-Asp/GC修饰电极重复制备5次,浸没在7.5×10-5mol◦L-1的FA溶液中进行测定,相对标准偏差(RSD)为2.3%.室温下,修饰电极在PBS(pH为6.84)缓冲溶液中放置24 h,电流峰值衰减约7%.以上数据表明,poly-Asp/GC修饰电极具有良好的重现性,但稳定性不太高,考虑到电极的制备简易、快速、方便,因而此缺点对其实际应用影响不大.由3倍信噪比方法得出检测限为3.1×10-7mol◦L-1.

2.6 应用

本文方法被用于测定实际样品逍遥丸中FA的含量.逍遥丸是我国传统的中成药,用于治疗月经不调、腹胀痛、头晕、食欲不振等,其主要成分有柴胡、当归、白芍、黄芪等[16].检测步骤如下:将12粒逍遥丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司)烘干后研磨成粉末,称取0.25 g粉末溶解在100 mL,0.1 mol◦L-1HAc-NaAc缓冲溶液(pH为4.5),超声震荡30 min.室温下静置20 min,取上层清液为试样溶液,采用标准加入法进行测定.每一样品平行检测3次取平均值.如表1所示,回收率大约为97.9%～102.2%.FA的平均浓度为3.08×10-5mol◦L-1,由此推算得逍遥丸中FA的含量为2.39 mg◦g-1.文献[17]采用反相高效液相色谱法检测不同逍遥丸样品中FA的含量,报道值为1.144～4.722 mg◦g-1,与本文的结果接近,表明本文方法具有高的灵敏度,可用于实际样品中FA的检测.

表1 逍遥丸中FA的检测Tab.1 Determination of FA in Xiaoyao Pills

3 结语

本文采用电聚合的方法制备了聚天冬氨酸修饰玻碳电极,此电极显著地提高了FA的电信号强度,通过测定微分脉冲氧化峰电流,实现了中成药逍遥丸中FA的定量检测.方法简便、快速、实用.

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