化瘀泄浊方对肾间质纤维化实验大鼠整合素连接激酶的影响*

王彦凯，潘利敏，王凤丽，李林林，袁国栋，王月华

慢性肾脏病患者肾间质纤维化(tubulointerstitial fibrosis，TIF)的严重程度较肾小球病变更为重要［1］。肾小管上皮细胞转分化(renal tubular epithelial to mesenchymal transition，EMT)在 TIF发生发展中具有重 要 作 用［2］。 转 化 生 长 因 子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前所公认的导致肾脏纤维化的重要因子，在 TGF-β诱导的 EMT过程中整合素连接激酶(integrin linked kinase，ILK)起重要作用。研究提示，ILK在 TGF-β1/Smad信号传导途径介导的EMT过程中扮演重要的角色，在肾间质纤维化的病程中起重要作用［3-5］。

我们在临床中用化瘀泄浊方治疗慢性肾衰竭取得了较好的疗效。同时我们在前期的实验中已经证实，化瘀泄浊方能够抑制肾小管上皮细胞转分化，并能够通过调节TGFβ1/Smad信号通路发挥对肾间质纤维化的拮抗作用［6-7］。因此，本研究进一步探讨化瘀泄浊方对肾间质纤维化大鼠ILK的影响，为进一步探讨肾间质纤维化发生、发展的机理，探讨化瘀泄浊方多途径、多靶点拮抗肾间质纤维化的治疗作用寻找实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选用雌性、健康SD大鼠50只，体重180g±10g，清洁级，由河北医科大学动物实验中心提供(动物合格证号冀医动管字第703058号)。

1.1.2 主要试剂 兔抗大鼠ILK多克隆抗体由美国Santa Cruz公司提供。脱氧核糖核苷三磷酸(d NTPs)、核糖核酸酶抑制剂(Rnasin)、AMV逆转录酶、无离子水、GoTaq Green Master Mix、Oligo(dT)15由美国 Promega公司提供。Trizol由美国Invitrogen公司提供，溴化乙锭(EB)由美国 Sigma公司提供，琼脂糖为西班牙进口分装，DNA Marker由上海捷瑞生物工程有限公司提供。

1.1.3 实验用药 化瘀泄浊方:黄芪30g，地龙 12g，生大黄 12g，赤芍 15g，丹参 15g，槐花 15g，蒲公英15g，生牡蛎30g。由河北医科大学中医院药房提供，上药按比例称取后水煎、过滤、浓缩，装入瓶中密封备用。西药对照药:缬沙坦(批号X0538)由北京诺华制药有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 动物模型与分组 动物随机分为假手术组(简称SHAM组)、模型组(简称UUO组)、化瘀泄浊方组(简称 UUOZ组)、缬沙坦组(简称 UUOV组)、阿魏酸哌嗪分散片组(简称 UUOA组)，每组10只。除假手术组外其余各组均行左侧输尿管结扎术［8］。手术前 1d开始给药，化瘀泄浊方组大鼠经口灌服化瘀泄浊方5.7g/(kg·d);阿魏酸哌嗪分散片组大鼠经口灌服阿魏酸哌嗪分散片6.7mg/(kg·d);缬沙坦组大鼠经口灌服缬沙坦5.3mg/(kg·d);假手术组和模型组灌服同等量生理盐水，给药至实验结束前1d。于实验第21天全部杀检，取左侧肾脏去掉被膜，滤纸吸干血迹，取部分肾皮质保存于－80℃冰箱中用于RT-PCR，部分用4%多聚甲醛固定，留作常规病理学观察及免疫组织化学观察。

1.2.2 免疫组织化学方法 SABC法。半定量分析:采用HPIAS-1000型全自动彩色病理图像分析系统，在200倍光镜下采集图像，每例各选15个视野，计算1个视野中阳性细胞百分数，在光亮度和放大倍数一致的条件下对免疫组化结果进行自动测量，最后取平均值。

1.2.3 RT-PCR ILK引物:长度 400 bp。上游引物:5’-GCACTCAATAGCCGTAGTG-3’，下游引物:5’-CCTACTTGTCCTGCATCTTC-3’，反应条件:94℃预变性 5min，94℃ 50s，56℃ 60s，72℃ 1min，共32个循环，最后72℃ 8min充分延伸。GAPDH:长度452bp。上游引物:5’-ACCACAGTCCATGCCAT CAC-3’，下游引物:5’-TCCACCACCCTGTTGCTTA-3’，扩增产物反应条件:94℃预变性3min 94℃ 45s，60℃ 60s 72℃ 1min，共 38个循环，最后 72℃ 7min充分延伸。将 PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳，置于凝胶图像分析系统 (UVP公司，美国 )进行吸光度扫描，以管家基因 GAPDH作为内参照校正，用目的基因的吸光度与 GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。每个样本的每个指标重复做3次，取其均值。

1.3 统计学处理方法

采用SPSS13.0统计软件包进行统计分析，采用One-Way ANOVA，组间两两显著性比较采用 LSD法，显著性标准为P＜0.05。

2 结果

2.1 ILK蛋白的表达、分布及半定量分析结果

ILK主要表达于肾小管上皮细胞胞浆中，假手术组ILK在肾小管上皮细胞中表达很弱。与假手术组比较，模型组和各治疗组ILK的表达显著增强，差异有统计学意义(P＜0.05);与模型组相比，化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组、缬沙坦组ILK的表达减弱，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中化瘀泄浊方组ILK的表达优于阿魏酸哌嗪分散片组，差异有统计学意义(P＜0.05)，其他各组间均无明显差异(P＞0.05)(表1)。

2.2 ILK mRNA的表达及半定量分析结果

ILK RT-PCR半定量分析结果显示，与假手术组比较，模型组和各治疗组ILK的表达显著增强，差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组相比，化瘀泄浊方组、阿魏酸哌嗪分散片组、缬沙坦组ILK的表达减弱，差异有统计学意义(P＜0.05)，其中化瘀泄浊方组ILK的表达弱于阿魏酸哌嗪分散片组，差异有统计学意义(P＜0.05)，其他各组间均无明显差异(P＞0.05)(表 1)。

3 讨论

本病属于中医的“虚劳”、“腰痛”、“淋证”、“关格”、“癃闭”等范畴，其病因病机有以下几个方面:①先天异常:慢性肾衰竭的病因与患者素体虚弱、加之过劳、外邪等诱因密切相关。正虚之中尤以气虚为主，或兼气阴两虚，邪实有外邪、水停、湿浊、蕴痰、瘀血等多种。治疗慢性肾衰时应首先重视权衡标本缓急，缓则治本，采用相应的益气、养阴、助阳之法以扶助正气固本。同时，“久病必瘀”，血不利则为水，瘀血阻滞，水湿郁结于内;或瘀血内阻，气滞血瘀。总之，本病是以湿热、瘀血、络阻、气虚等为基本病机，且相互转化、相互影响。本实验针对上述病机提出以化瘀通络、泄浊解毒为治疗大法，兼以益气，自拟化瘀泄浊方治疗本病。方中地龙、赤芍、丹参、大黄化瘀通络，槐花、公英清热利湿、解毒泄浊，生牡蛎软坚散结，黄芪益气且有走而不守之性，不仅可以扶正固本，还可以助丹参、地龙等化瘀通络、祛邪治标，诸药相伍通补并用，标本兼顾。

表1 各组大鼠ILK蛋白和基因的表达(珋x±s)

肾间质纤维化主要表现为细胞外基质(extracellular matrix ECM)的大量积聚和间质肌成纤维细胞(Myofibroblast，MyoF)的增生。MyoF是合成细胞外基质的主要细胞，MyoF数量与RIF的程度成正相关，被认为是预测RIF最好的指标。MyoF除了小部分直接由成纤维细胞活化而来以外，还有相当一部分由肾小管上皮细胞转化而来。这一过程称为小管上皮细胞-肌纤维细胞转分化(renal tubular epithelial to mesenchymal transition，EMT)［10］，EMT在肾间质纤维化的形成过程中起到关键性的作用［2］。研究 表 明，ILK参 与 了 EMT的 多 个 过程［2、11］。另有研究表明，TGF-β1 是目前所公认的致肾纤维化重要因子，它能通过多种途径参与 EMT，在TGF-β诱导的 EMT过程中 ILK起重要作用，可以阻止EMT的发生。同时有研究证实，抑制Smad信号途径后，能抑制 TGF-β1引起的 ILK表达增多和EMT，所以 ILK可能是 TGF-β1激活的信号通路下游的一个重要因子，在EMT中发挥着重要作用。即ILK因为参与 TGF-β1/Smad信号通路进而参与EMT，是EMT过程中的一个重要调节者，在肾间质纤维化的发生中有重要作用［3、4］。

在前期研究中，我们通过观察TGFβ1和磷酸化Smad2/3(p-Smad2/3)的表达，证实了化瘀泄浊方能够通过抑制肾组织 TGFβ1、p-Smad2/3蛋白的表达，从而延缓病变肾组织纤维化进程，发挥对肾间质纤维化的拮抗作用［6、7］。本项研究中，我们继以化瘀泄浊方对肾间质纤维化大鼠进行干预性治疗，观察了在EMT过程中起关键作用的TGF-β下游因子-整合素连接激酶(ILK)。结果显示，化瘀泄浊方对肾间质纤维化大鼠具有明确的治疗和保护作用，能减轻肾脏病理损害，减少纤维化面积。我们通过用免疫组化和RT—PCR检测ILK蛋白及其mRNA在肾间质纤维化大鼠肾组织中的表达情况，结果发现化瘀泄浊方对于肾间质纤维化大鼠肾组织中ILK的表达具有一定的抑制作用，从而减少肾小管上皮细胞转分化，使病变肾组织ECM合成减少，发挥对肾间质纤维化的治疗作用。

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