氧化应激调控的神经细胞NF-κB表达

张仁云,李 申,刘 丹,李 洁

(天津医科大学精神医学教研室,天津 300070)

帕金森病(PD)是一种常见的中枢神经系统变性疾病,主要病理改变为含黑色素神经元变性丢失,黑质致密部多巴胺能神经元尤为显著。神经黑色素最初在富含儿茶酚胺能神经元的黑质和蓝斑中发现,研究表明在不同的生理条件下神经黑色素可能在 PD发病中起到保护或者毒性作用[1,2]。PD病因至今未明,但氧化应激在细胞变性死亡过程中发挥重要作用这一观点被普遍接受。NF-κB是一种广泛存在于体内多种细胞的核转录因子,参与多种疾病病理生理、多种基因调控、机体免疫应答和细胞凋亡的信号传导过程。近年研究发现,NF-κB和PD的发病有关。2008年 12月 ～2009年 10月,我们用芬顿试剂(FR)作为诱导神经元细胞和神经胶质细胞氧化应激的基本条件,在有或者没有人类神经黑色素(hNM)、多巴胺黑色素(DAM)、铁螯合剂去铁胺(DFO)等不同条件下培养细胞,观察NF-κB mRNA基因表达水平的变化。

1 材料与方法

1.1 hNM的制备 人脑组织来自德国维尔茨堡大学人脑库,通过中国和德国的伦理委员会批准,供者均没有神经或者精神疾病。hNM的分离如文献[3]描述的方法完成。DAM的制备根据Ben-Shachar等[4]的描述进行。

1.2 细胞培养和处理 SK-N-SH是人类神经母细胞瘤细胞系,U373是人类胶质母细胞瘤细胞系,细胞培养的方法如文献[4]。本实验的细胞样本分两组,即对照组和处理组(FR、hNM、FR+hNM、DAM、FR+DAM、DFO、DFO+FR、DFO+hNM、DFO+FR +hNM、DFO+DAM、DFO+FR+DAM)。hNM样本的准备是在DMEM中超声溶解,最终得到均匀的黑色素颗粒悬浮液。将悬浮液加入新鲜培养基中进行培养,使终浓度达到50或100 ng/ml。FR的配制为：400μmol/L FeSO4+200μmol/L H2O2。

1.3 实时定量PCR法检测NF-κBmRNA的表达所有RNA的提取按照QIAGENR公司的RNA提取试剂盒说明书进行。根据试剂盒说明书,使用由BioRad Laboratories公司的iScriptTMcDNA合成试剂盒,利用引物Oligo-d(T)和random hexamers完成互补DNA(cDNA)第一链的合成。最初,我们测定了6个管家基因,包括ACTB、ALAS1、GAPDH、RPS18、RPL13A和PPIA。通过程序geNorm(版本3.3;网址：http：//medgen31.ugent.be/jvdesomp/genorm/)测算出前三个管家基因最稳定,因而选择它们计算标准化因子。通过实时定量 PCR法对不同方法处理的细胞中NF-κB的cDNA表达进行分析。

1.4 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件,数据来自三次独立的实验,数据分析使用Microsoft Excel 2000生成原始表达式的值,数据比较进行单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氧化应激诱导的NF-κB mRNA在神经细胞SK-N-SH的表达 与对照组相比,SK-N-SH细胞在经过FR、FR+hNM、FR+DAM处理后,NF-κB的基因表达明显上升(P均＜0.05)。加入DFO前后两组相比,仅NM和DFO+hNM未出现明显变化,其他各组在加入DFO后细胞NF-κB的基因表达均有了明显降低(P均＜0.05)。与DFO组相比,仅DFO +FR+DAM组NF-κB的基因表达显著上升(P＜0.05)。FR+DAM组和FR组相比,NF-κB的基因表达显著上升(P＜0.05)。见图1。

图1 NF-κB mRNA在SK-N-SH中的表达

2.2 氧化应激诱导的NF-κB mRNA在神经细胞U373的表达 与对照组相比,U373细胞在经FR+ DAM处理后,NF-κB的基因表达显著上升(P均＜0.05)。加入DFO前后两组相比,仅DFO+FR+ hNM组与FR+hNM组,DFO+FR+DAM组与FR +DAM相比细胞NF-κB的基因表达有显著降低(P均＜0.05)。与DFO组相比,DFO+FR,DFO+ DAM,DFO+FR+DAM组NF-κB的基因表达均有了显著增高(P均＜0.05)。见图2。

图2 NF-κB m RNA在U 373中的表达

3 讨论

NF-κB在所有的细胞类型中都有表达,在功能上为一序列特异性转录因子[5]。PD患者脑组织研究显示,NF-κB在黑质纹状体的含量比正常对照明显增高。NF-κB反映细胞凋亡和大脑炎症状态,并且NF-κB参与了黑质纹状体多巴胺能神经元的变性过程[6]。

本研究中,FR作为氧化损伤的直接诱导,使得SK-N-SH细胞处于氧化应激的环境,结果显示NF-κB处于过表达状态,与Zecca等[7]研究结果一致。hNM本身未能增加NF-κB mRNA的表达,而FR+ hNM使该基因表达明显上调。这一结果表明,生理条件下,hNM对神经元NF-κB mRNA无影响,而当铁浓度升高时,诱导了NF-κB mRNA的表达。既往有研究表明,hNM可结合金属离子特别是铁离子,以调节细胞内的氧化应激水平[8]。hNM结构中有铁的高结合位点和低结合位点,生理条件下,细胞内的游离铁稳定地结合在hNM的高结合位点;但当铁的浓度升高时,hNM分子中铁的高结合位点饱和后,铁与低结合位点不稳定结合,反而导致细胞损伤显著[3,9]。本研究中,FR+hNM恰好模拟了PD患者黑质中铁含量增高的环境,超过了hNM的铁高结合位点的结合能力,因而使细胞处于氧化应激状态, NF-κBmRNA出现反应性上调。

由于从人脑中分离出hNM量少且困难,大多数功能性研究都是利用人工合成的 DAM来代替hNM。在本研究中DFO+FR+hNM处理组和DFO +FR+DAM处理组神经元细胞NF-κBmRNA的基因表达有统计学差异,说明在体外 DAM不能模拟hNM的生理功能。这和既往研究[3]结果 DAM和hNM之间存在结构上和功能上的差别一致。与 FR组相比,FR+DAM诱导神经细胞NF-κBmRNA的基因表达上出现了明显改变,说明在有铁离子存在的情况下,DAM的氧化活性增强,提示DAM在氧化应激条件下可诱导神经元细胞凋亡[10]。

DFO去铁胺是一种铁螯合剂,在本实验中铁离子被去铁胺螯合后,NF-κBmRNA在SK-N-SH细胞中的表达显著下降,与既往研究[3]结果DFO可以明显减少FR试剂诱导的细胞损伤,而起到神经保护作用一致。在本研究中氧化应激诱导的人类神经胶质细胞NF-κB mRNA的基因表达和对照相比,在DFO+hNM处理组出现明显减低,这可能与DFO螯合了hNM中的铁离子,减低了细胞的氧化应激有关。此结果说明在氧化应激条件下,神经胶质细胞可能通过过度表达 NF-κB来抵抗氧化应激造成的损害,起到神经保护作用。

综上所述,本研究证明,NF-κB在氧化应激条件下在神经元细胞内表达增加,为NF-κB对神经元细胞有保护作用提供了新的证据。NF-κB在神经元细胞和神经胶质细胞内相同条件下基因表达的变化不同,提示这两种细胞的生物学行为存在差异,神经元细胞可能比神经胶质细胞对氧化应激更为敏感。

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