非小细胞肺癌患者手术治疗前后外周血Th1、Th2、Th17细胞水平变化

郭鸿超,李 卉,庞作良＊

(1新疆医科大学附属肿瘤医院,乌鲁木齐 830011;2新疆医科大学基础医学院)

肺癌的发生、发展及预后与机体的免疫功能状态密切相关。辅助性T淋巴细胞(Th)是CD+4T细胞的主要亚群,根据其分泌的细胞因子不同可分为Th1、Th2、Th17三个亚群,分别在抗肿瘤免疫、肿瘤免疫逃避和耐受机制、肿瘤免疫微环境和机体免疫稳态中发挥重要作用。2010年 7～11月,我们观察了非小细胞肺癌(NSCLC)患者根治性手术治疗前后外周血Th1、Th2、Th17细胞水平的变化,并探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 NSCLC患者27例,男18例,女9例;年龄 30～70岁。有淋巴结转移 12例,无淋巴结转移15例;组织分类为鳞癌16例,腺癌11例;组织分化程度为高分化 5例,中分化 15例,低分化 7例; UICC分期ⅠA期2例,ⅠB期4例,ⅡA期3例,ⅡB期 11例,ⅢA期 7例。患者均行肺癌根治性手术,术后常规病理检查确诊。标本采集前未行化疗、放疗及免疫治疗等。

1.2 Th1、Th2、Th17细胞检测方法 于术前3 d和术后14 d清晨空腹状态下留取患者肘静脉血5 ml,肝素钠抗凝,1 h内开始预处理。①刺激培养：取抗凝混匀全血1m l+含10%胎牛血清的RPMI1640液1m l+BFA 10μl/ml+PMA 20 ng/m l+离子霉素1 μg/ml,吹打混匀,5%CO2、37℃孵育5 h。②胞外染色：将刺激培养的标本分为 3管,各 500μl,用 PBS洗1遍,1 200 r/min离心5min,吸上清。每管加PEcy7-anti-CD4抗体10μl,振荡混匀,室温避光15 min。③溶血及破膜：每管加10倍稀释的FACS溶血素2ml,室温避光10 min。1 500 r/min离心5 min弃上清。1%多聚甲醛固定细胞,各管加 10倍稀释的FACS通透剂0.5 ml,室温避光10 min,加PBS 2 ml,1 500 r/min离心5 min弃上清。④胞内染色：设1管为对照管,加同型对照FITC-anti-IgG2a/PE-anti-IgG1抗体10μl;余2管为试验管,分别加抗体FITC-anti-IFN-γ/PE-anti-IL-4、PE-anti-IL-17各10μl,混匀后室温避光30min。每管加1%多聚甲醛 500μl,流式细胞仪检测。⑤结果判读：在Cell Quest软件下获取1万个细胞,FACSCaliber型流式细胞仪测定淋巴细胞胞内和胞膜各种荧光素的荧光强度。用PEcy7标记的CD4单抗和侧向角散射光双参数圈出CD4阳性细胞群,空白对照和阴性对照消除自发荧光和非特异荧光,Dot2 Plot点图测算Th1(CIFN-γ+)、Th2(CIL-4+)、Th17 (CIL-17+)细胞百分比。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。正态分布的计量资料比较用自身配对 t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

27例NSCLC患者手术治疗前后外周血Th1、Th2、Th17细胞水平比较,见表1。

3 讨论

表1 27例NSCLC患者手术治疗前后外周血Th1、Th2、Th17细胞水平比较(±s)

表1 27例NSCLC患者手术治疗前后外周血Th1、Th2、Th17细胞水平比较(±s)

注：与术前相比,＊P＜0.05,△P＜0.01

观察时间 Th1(%) Th2(%) Th1/Th2 Th17(%) Th/CD+ 4术前 24.47±10.34 22.16±9.98 1.58±1.44 1.68±1.10 47.30±10.52术后 27.91±7.06 12.39±7.84△ 5.44±13.26 1.12±0.46＊ 42.86±10.29

在肿瘤发生发展的整个过程中,免疫系统既可对抗肿瘤细胞,又有利于肿瘤细胞逃避宿主免疫系统的攻击[1]。Th1主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-β等效应因子,介导细胞免疫应答,是机体抗肿瘤免疫的主要形式。Th2以分泌IL-4、IL-6、IL-10为主,主要介导体液免疫应答。正常情况下两者处于相对平衡状态。当Th1/Th2平衡偏向其中一方,即为“Th1 /Th2平衡漂移”,可能造成人体细胞因子网络的动态平衡被破坏,进而引起许多疾病。Yamamura等[2]发现,基底细胞癌变部位Th2型反应增强,而良性肿瘤则以 Th1型反应为主。乳腺癌[3]、肺癌[4]、上皮性卵巢癌[5]等肿瘤中 Th1及其相关因子表达减少, Th1/Th2降低以及Th1向Th2飘移,使机体处于免疫抑制状态。本研究表明,NSCLC患者术前外周血Th2呈优势表达,术后Th2表达明显减弱,而Th1在术后表达较术前稍有增加。说明肺癌患者手术后抗肿瘤免疫功能并未增强。Ito等[6]研究发现,肺癌患者外周血Th1/Th2明显降低的患者比Th1/Th2正常者更容易出现术后复发。因此,对术后Th1/Th2较低的肺癌患者给予 Th1型细胞因子治疗,可能对减少术后复发以及改善长期预后有益。

Th17细胞以分泌IL-17为主,其在肿瘤免疫中的作用尚存在争议。有研究表明,肿瘤细胞高表达IL-1β、IL-6、IL-8、干扰素诱导蛋白-10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和血管内皮生长因子(VEGF)等细胞因子,对Th17细胞在肿瘤微环境中的分化起着重要的促进作用[7,8]。本研究中,NSCLC患者手术治疗后外周血Th17细胞较手术前明显降低,表明肿瘤负荷时Th17细胞高表达。抑制Th17细胞的高表达有可能成为肺癌免疫治疗的新靶点。

综上所述,根治性手术治疗后NSCLC患者的免疫抑制状态有一定改善,但并不伴有抗肿瘤免疫的增强。因此,NSCLC患者术后应给予免疫支持治疗,进一步纠正Th1/Th2的失衡,这对重建机体免疫功能具有重要意义。

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[3]徐淑芹,黄兴富,范华.乳腺癌患者Th1/Th2型细胞因子的表达及临床意义[J].山东医药,2008,48(28)：72-73.

[4]黄萍萍,唐德燊,吴平.肺癌患者Th1/Th2细胞因子的免疫反应状态变化及临床意义[J].实用医技杂志,2007,14(13)：1657-1658.

[5]袁少洋,王爱丽,庞启贞.上皮性卵巢癌患者外周血Th1/Th2细胞因子表达水平的变化[J].第四军医大学学报,2008,29(17)：1625-1627.

[6]Ito N,Nakamura H,Tanaka Y,et al.Lung carcinoma：analysisof T helper type 1 and 2 cells and T cytotoxic type 1and 2 cells by intracellular cytokine detection with flow cytometry[J].Cancer,1999, 85(11)：2359-2367.

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