中国虎纹蛙种质资源研究进展*

2011-02-19田永斌夏明明

浙江师范大学学报（自然科学版） 2011年4期

田永斌，夏明明，邵晨

(浙江师范大学生态学研究所，浙江金华 321004)

虎纹蛙(Hoplobatrachus rugulosus)曾广泛分布于我国南方各省，由于其个体大、肉味鲜美、营养丰富，是一种很好的食用蛙，多年来一直遭到过度捕捉，再加上生境退化及农药滥用等因素的影响［1］，虎纹蛙的野生资源急剧减少．为了满足市场需求及保护自然资源，人们开展了虎纹蛙的人工养殖，并取得了一定的成效．然而，目前虎纹蛙的人工养殖存在一些问题，对虎纹蛙种质资源质量存在着较大的隐患．

保护种质资源已经成为当今世界一股强劲的潮流．为保护和持续利用种质资源，迫切要求种质标准的建立．本文从形态学水平、细胞学水平、生化和分子遗传学水平等层面对虎纹蛙资源的研究状况进行了总结与探讨，并对虎纹蛙的养殖状况及存在的问题进行了分析，为虎纹蛙种质标准、资源保护措施及持续发展我国虎纹蛙养殖业相关措施的制定与进一步研究提供参考资料．

1 中国虎纹蛙分类地位、分布及资源现状

1．1 分类地位及分布

虎纹蛙，俗称水鸡、田鸡、青鸡、泥蛙、虾蟆等，隶属于脊索动物门(Chordata)脊椎动物亚门(Vertebrata)两栖纲(Amphibia)无尾目(Anura)叉舌蛙科(Dicroglossidae)虎纹蛙属(Hoplobatrachus)．虎纹蛙属约有 H．crassus，H．occipitalis，H．rugulosus和 H．tigerinus 4个(亚)种，中国和泰国各有1种，即中国虎纹蛙(H．rugulosus)和泰国虎纹蛙(H．occipitalis)．

中国虎纹蛙的分布范围较广，我国河南、陕西、四川、云南、贵州、湖北、安徽、江苏、浙江、江西、湖南、福建、台湾、广东、海南、广西和香港等地均有分布，国外还见于缅甸、泰国、越南和马来西亚等地区［2］．

1．2 资源现状

1989年，虎纹蛙被列为国家Ⅱ级保护动物，受到国家法律的保护，同时也是唯一列入国家重点保护野生动物名录的蛙类;1996年，虎纹蛙被列入中国红皮书等级;1997年，虎纹蛙被列入华盛顿公约(CITES)濒危等级，附录2;2003年，虎纹蛙又被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录Ⅱ珍稀濒危物种名录中;2004年，虎纹蛙被列入《中国物种红色名录》易危物种等级．

虎纹蛙曾广泛分布于我国华东、华南、华中和西南等地区［3］，但近年来一部分地区已不见野生虎纹蛙的踪影［4］．由于栖息地被破坏及过度捕捉，虎纹蛙野生资源遭到严重破坏，其数量正呈不断下降的趋势［5］．

目前，虎纹蛙分布范围及种质资源不断萎缩，资源状况不明．所以，对不同地理种群现有虎纹蛙资源的野外调查，将会为科学评估虎纹蛙资源现状，从而制定相应的保护措施提供宝贵信息;另外，也为进一步的虎纹蛙种质研究和资源利用积累丰富的材料．

2 虎纹蛙种质资源研究进展

2．1 形态学研究

形态学标记是传统的研究物种差异的分类方法，主要是根据生物体形态特征的差异进行物种的划分．

而虎纹蛙的形态学研究只有少数报道．邵晨等［6］对浙江金华繁殖期虎纹蛙的部分形态特征进行过简单的描述;林植华等［7］对浙江丽水地区虎纹蛙的11个指标进行了测量，并对雌雄差异进行了研究分析，结果表明虎纹蛙头长、四肢、眼径、耳径等特征存在一定的两性异形现象，其中最显著的两性异形特征是体长．

形态学研究方法简单直观，容易观察记录，长期以来物种的分类及资源鉴定都是以形态标记为主要的或初步的指标．所以，对于中国虎纹蛙各地理种群的形态学研究还有待开展．但是，不同的学者选择不同的形态指标进行测量分析，可能会导致对同一物种的分析结果不一致．而且，形态和表型特征易受环境条件、人为因素、测量工具及基因显隐性等因素的影响，并不能完全真实全面地反映物种的遗传多样性．因此，要更加准确、细致地了解种群的遗传变异状况，还必须结合细胞、生化及分子水平等方面的分析和研究．

2．2 细胞遗传学研究

细胞学标记主要是指染色体核型(染色体数目、大小、随体、着丝点位置等)及带型(C带、G带、N带等)．其中染色体组型(核型)的研究是细胞遗传学的基础，是分类和系统发生研究较为有力的遗传学证据，并具有物种的特异性．所以，一直以来关于无尾两栖类细胞遗传学研究的大部分集中于染色体组型的研究［8-14］．

我国关于虎纹蛙组型的研究主要集中在20世纪80年代．张维道［15-16］采用骨髓细胞滴片法和5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)对安徽芜湖地区虎纹蛙的染色体组型进行了研究，并对虎纹蛙G-带进行了初步分析，研究发现:芜湖产虎纹蛙二倍体染色体为26(2n=26)，包括5对大型染色体和8对小型染色体，其中包括8对中着丝粒染色体和5对亚中着丝粒染色体;在No．6，No．8的长臂和No．2的短臂上具有次缢痕．李树深等［17］报道云南蒙自地区虎纹蛙核型是2n=26(22 M+4 SM)，可分为2大组:1～5对为A组，属大型染色体;6～13对为B组，属小型染色体;No．3和No．6为亚中央着丝点染色体，其余均为中央着丝点染色体;No．6的长臂近着丝点区域有次缢痕．章菊明等［18］、刘楚吾等［19］和方玲等［20］分别对浙江温州地区、湖南汉寿地区和广西南宁地区的虎纹蛙进行了染色体组型研究，与李树森的分析结果相似．

文献［21］指出，次缢痕的位置、数目和相对长度是染色体的分类特征之一．通过对上述学者对安徽芜湖、云南蒙自、浙江温州、湖南汉寿及广西南宁5个地区虎纹蛙染色体组型的研究进行比较分析，我们发现各地理种群虎纹蛙染色体的相对长度、臂比指数、次缢痕的数目和分布及亚中着丝粒染色体的多少都存在一定的差异性．

另外，胡知渊等［22］应用Giemsa染色法对浙江金华地区棘胸蛙、虎纹蛙和黑斑蛙的血细胞进行了显微观察和各形态参数测定，结果表明红细胞和白细胞的形态和数量比例有一定属和种的特征．这表明将血细胞的研究作为种质鉴定的指标也是具有可行性的．

2．3 生化遗传学研究

生化遗传标记即基因产物标记，如血清蛋白、同工酶、等位酶等的标记．同工酶标记是一类新型的遗传标记方法，实验方法规范、简便和快速，是一种较好的种质资源检测方法．用于无尾两栖类种质鉴定的生化遗传标记多为同工酶标记［23-25］．

刘楚吾等［19］对湖南汉寿地区的牛蛙、黑斑蛙和虎纹蛙3种蛙的晶体、脑、心脏和肌肉4种组织的乳酸脱氢酶同工酶进行了研究，表明3种蛙存在着乳酸脱氢酶同工酶的组织特异性和种的特异性．范燕等［26］对虎纹蛙胚胎发育各阶段的酯酶(EST)、苹果酸脱氢酶(MDH)和乳酸脱氢酶(LDH)进行了研究，结果发现其不同生长阶段的酶谱不完全相同．陈才法等［27］采用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法，研究并比较了采自安徽省六安市的虎纹蛙和江苏省徐州市的金线蛙的脑、肝、心脏、骨骼肌4种组织的LDH同工酶，结果显示LDH同工酶具有一定的组织特异性，并且在肝脏、心脏和骨骼肌中表现出一定的种间差异．

2．4 分子遗传学研究

近些年来，随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已有数十种，用于种质鉴定的DNA标记方法的发展也极其迅速，主要有限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)标记、微卫星 DNA(SSR)标记、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术和线粒体DNA(mtDNA)标记等．有关无尾两栖类的分子标记方法主要集中于mtDNA［28-29］，ISSR(inter-simple sequence repeat)［30］，RAPD［31］和SSR［32］等．

刘丽等［33-34］应用RAPD技术研究了中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙的种内种间遗传多样性及种质特异性标记，指出:2种虎纹蛙的遗传多样性都比较丰富，但野生的中国虎纹蛙种群的遗传多样性还不如经多代驯化和养殖的泰国虎纹蛙种群的丰富;并在基于RAPD的基础上运用序列特异性扩增技术(SCAR)设计出鉴定2种虎纹蛙的分子标记，为中国虎纹蛙和泰国虎纹蛙的发展趋势的监测及品种的鉴定提供了理论依据．

黄建伟等［35］通过比较虎纹蛙、黑斑蛙、金线蛙、泽蛙、凹耳蛙和福建大头蛙6种蛙的16 S rRNA的序列和二级空间结构，发现空间结构分析与序列比较结果存在一定的差异，虎纹蛙、黑斑蛙和泽蛙的二级结构相似，但与黑斑蛙同属的金线蛙存在较大差异，凹耳蛙和福建大头蛙与其他蛙类的二级结构差别较大，证实了二级结构也能作为系统发育的资料以确定进化关系．

3 虎纹蛙人工养殖及存在问题

为了满足市场需求及保护自然资源，罗琛等［36］首次开展了虎纹蛙人工养殖的初步研究．随后，许多学者对虎纹蛙人工养殖的相关技术进行了研究和探讨，基本上解决了人工养殖［37-38］、人工繁殖与育苗［39-40］等一系列关键技术．

近几年我国虎纹蛙养殖业在南方部分地区得到了较快发展，尤其是生态种养实验取得了良好的经济、生态和社会效益．例如:黄志平［41-42］先后开展的水稻、虎纹蛙生态种养实验和虎纹蛙、鱼、林生态种养实验;钟传明［43］对杂交虎纹蛙水稻种养技术的研究;吴建平［44］“水稻-虎纹蛙”生态农业模式的研究等，都取得了显著的成果．

虽然虎纹蛙的人工养殖取得了一定的成功，减轻了对野外种群的压力，但是还存在一些问题:

1)人工养殖至今没有一个标准，缺乏人工选育的优良品种，繁殖群体的选择存在一定的盲目性．不少地方养殖场初始繁殖种群大都是收购或捕捉的野生种群．

2)品种交流存在一定的随意性，人为虎纹蛙杂交现象严重．因目前未建立虎纹蛙苗种注册制度，各地虎纹蛙的种苗都是流通的，导致各地品种交流频繁，最终导致遗传多样性下降和种质退化．

3)引种忧患．1995年首次引进了外形酷似中国虎纹蛙的泰国虎纹蛙［45］，新品种的引进暂时缓解了市场供需矛盾，但是泰国虎纹蛙的早期胚胎发育所需时间比中国虎纹蛙少22．1 h［46］，也就是胚胎发育阶段泰国虎纹蛙比中国虎纹蛙生长快．并且，与中国虎纹蛙相比，泰国虎纹蛙的遗传多样性丰富、环境适应能力强．由于泰国虎纹蛙与中国虎纹蛙竞争相同的生态位，所以繁殖能力和适应能力强的泰国虎纹蛙很有可能完全侵占中国虎纹蛙的生态位，从而使中国虎纹蛙处于更加濒危的境地［33］．有调查发现，在市场价格比较低或养殖池中出现病蛙时，蛙农就放弃养殖，将泰国虎纹蛙成池地随意放到周边自然环境中［47］，可能导致中国野生虎纹蛙个体基因组成的改变，使得原种种质资源遭到污染，生存受到威胁．

4 虎纹蛙种质资源保护建议

目前，对于虎纹蛙种质资源的保护和研究已刻不容缓．根据以上所述内容，我们建议对虎纹蛙种质资源的保护应做好以下方面的工作:

1)从虎纹蛙的资源现状来看，必须大力保护野生虎纹蛙的栖息地，明确现有资源现状并进行科学评价;对非法捕杀、贩卖野生个体的行为进行严厉打击;通过媒体加大保护野生个体的宣传力度;加强和健全保护区的管理制度．另外，对于一些具有代表性的种群或数量很少的种群，可以进行迁地保护．

2)从种质资源研究现状来看，有关虎纹蛙从种质角度进行的研究还较少．保护虎纹蛙种质资源就是保护虎纹蛙的遗传多样性．我们建议从形态水平、细胞水平、生化水平和分子水平等层面对本地种群的种质进行全面系统的研究，建立虎纹蛙种质标准;通过对各地理种群的研究，建立和完善虎纹蛙种质资源数据库．旨在为种质资源评价、保护和合理利用及后续的良种选育提供基础资料．

3)从人工养殖现状及存在的问题来看，为避免虎纹蛙种质受污染，保持种质的纯洁性，必须加强中国虎纹蛙的原种鉴定、保存及优良品种的选育;建立原、良种场，避免不必要的近交和近交衰退;规范苗种生产、销售行为，向社会提供优质的种苗;养殖场引种时要清楚种苗的遗传背景，不能为了追求经济利益而盲目引种．

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