组织工程中血管内皮生长因子的控制释放

崔新爱 王 玲 孔德领 顾汉卿

1(南开大学药学院和天津市分子药物研究重点实验室，生物活性材料教育部重点实验室，天津 300071)

2(天津市泌尿外科研究所，天津 300211)

引言

缺血性血管疾病包括冠心病和外周血管闭塞性疾病已成为世界上发病率和死亡率均占主导地位的疾病之一[1]。组织需要周围的毛细血管提供氧气和营养物质，供应不足就会导致缺氧，引起细胞凋亡。传统的血运重建治疗包括冠状动脉搭桥术(CABG)和经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)，对多数患者可以增加冠状动脉灌注，基本实现治疗目的，但对冠状动脉纤细和病变弥散的患者这些治疗手段则难以奏效。以改善缺血为目的，治疗性血管新生通过导入促血管生长因子，刺激新血管的形成和成熟，从而增加缺血部位的血液灌注已成为当前缺血性血管疾病治疗的研究热点。其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是动物实验和临床试验中研究最多的一种促血管生长因子。该生长因子是一种特异性作用于血管内皮细胞的多肽类因子[2]。尽管在缺血状态下，机体组织细胞中VEGF的表达会迅速增加，但是这种内生性VEGF的表达增加，常常不足以尽快建立侧支循环或恢复内皮细胞的完整性。当给予外源性VEGF后，新生血管则会明显增加，侧支血流供应改善，内皮依赖性功能和结构恢复[3]。

VEGF具有多种生物学活性，如促进血管内皮细胞增殖和血管新生、促进多种血管活性物质合成、促进血管舒张、抑制血栓形成、抑制血管平滑肌细胞增殖、参与卵泡的发育和成熟等[4-5]，其中促进血管内皮细胞增殖作用具有高度特异性。而且VEGF作为一种局部内生性调节剂，还起着维持血管的正常形态和完整性的作用[6]。

然而，与其它生长因子相似，VEGF由于半衰期短而导致体内降解速度过快，从而限制了它的临床应用。VEGF大剂量全身给药虽然可以促进局部血管生成，但也可以导致严重的副作用，常见的风险是VEGF可能促进肿瘤的血管新生，并且可能促进隐匿存在的恶性肿瘤的生长，还可能使增殖性或出血性视网膜病加重，以及反复性发作低血压、非靶向组织血管生成、动脉粥样硬化等，因此需要采取局部缓释的给药方式[7]。研究表明，VEGF缓释给药效果明显优于直接给药[8]。因此，越来越多的研究者利用各种控制释放载体，使VEGF在体内以一个恒定的速率释放，以保证其在治疗过程中在局部缺血组织中的含量，从而增加新生血管的形成。下面将逐一介绍几种VEGF控制释放体系在组织工程中的最新进展。

1 VEGF控释体系

1.1 VEGF-微球体系

生长因子缓释微球是指将生长因子溶解或分散在高分子材料基质中形成的粒径为1～250 μm的骨架型微小球状实体。缓释微球载体具有制备工艺简便、缓释药物、靶向输送，和在保证药物治疗作用的前提下减少给药剂量，降低药物毒性等优点[9]。

常用于VEGF控释的微球主要由乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)制备而成，这是因为PLGA降解速率适中，而且PLGA含有带负电的羧基能与带正电的VEGF相互作用。最近，Fabio等构建了直径约为5 μm 的 PLGA 微球来负载 VEGF[10]。该微球可持续释放活性 VEGF，每毫克微球载 VEGF为 0.58 μg，包封率约83.8%，可明显促进人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的增殖和分化，优于单用同等剂量VEGF的效果。分别用载 VEGF微球(2 mg微球)组、单纯VEGF注射组(100 ng)和空载微球组来治疗大鼠急性心肌梗死，在梗死边缘四个位点进行注射，四周后取材观察，结果显示载VEGF微球治疗组不仅促进了小口径血管的明显生长，对动脉血管的再生也有较大的促进作用，血管生成数几乎为单纯注射VEGF组和空载微球组的一倍。组织中的血管再生促进了整个组织的重塑，载VEGF微球治疗组与对照组相比大鼠左心室壁有明显的增厚，表明了该微球缓释系统在VEGF治疗缺血性疾病方面有潜在优势。

Lee等构建了PLGA微球和海藻酸钙水凝胶复合体系，将包裹人重组血管内皮生长因子(rhVEGF)的复合体系注射到小鼠皮下，观察新血管的形成[11-12]。3周内，rhVEGF从微球中缓慢持续释放，并保持活性。复合体系促内皮细胞增殖效果明显，且皮下注射后，小鼠心血管肉芽组织形成明显多于单剂量注射 VEGF。他们对构建的下肢缺血裸鼠，分别注射单纯 rhVEGF，载 rhVEGF水凝胶和载VEGF 微球-水凝胶复合体系(1 μg VEGF/mouse)，4周后复合体系的疗效最明显，裸鼠的后肢再生基本完整。充分表明该体系在治疗缺血性疾病方面的优势。Cristina等以Ⅰ型胶原为支架负载包裹VEGF的PLGA微球[13]，发现该复合体系可以长达10周持续释放有活性的VEGF;体内鸡胚绒毛尿囊膜模型实验观察到该体系显著提高了血管肉芽组织的形成，与直接加入VEGF的胶原支架相比，其新生血管数提高了2.5倍，且未出现异常性血管增生，表明支架中VEGF的控制释放对于治疗性血管新生的重要性。

微球载体是目前研究相对广泛也比较理想的药物载体，其制备方法简便，且通过化学或物理修饰与VEGF结合，载药量高，体外释放也均达到20 d以上。微球载体在体内治疗下肢缺血和心肌梗死方面有较好的疗效，使用载1 μg剂量的VEGF的载体进行治疗，一个月左右缺血部位即有显著的血管新生和组织再生;但由于其存在体内流动性且容易被巨噬细胞所吞噬等缺点，越来越多的研究者趋向于将缓释微球和其他材料(如胶体)复合，结合两者的优点达到更佳的缓释效果。

1.2 VEGF-纳米颗粒体系

生长因子缓释纳米粒是一类以天然或合成的高分子材料为载体的粒径为10～100 nm的固态载药胶体微粒，生长因子溶解在液态核中或吸附在其表面。与微球相比，纳米颗粒的制备技术相对要求较高，但其具有物理稳定性好、生物利用度高、有肝脾和骨髓靶向性、不易阻塞血管等优点。

Golub等构建了一种载 VEGF的可注射PLGA纳米颗粒体系(VEGF-NPs)，建立小鼠股动脉缺血模型测定其对小鼠后肢血运重建的作用，小鼠麻醉后将其股动脉和静脉结扎并将该区域切除，分别注射 VEGF-NPs、VEGF 和生理盐水[14]。4 d 后用三维断层扫描血管造影观察血管的生长和形态，结果显示VEGF-NPs处理组的小鼠与其它组相比总血管量和血管连接有明显增加，其血管形成总量超过VEGF组一个数量级，表明PLGA负载VEGF缓释纳米粒的促血管生成作用在组织工程和心血管药物的应用方面有着广阔的应用前景。

因为VEGF分子结构中含有能与肝素结合的结构域，因此Chung等开发了肝素修饰的 PLGA纳米粒子用于运载 VEGF[15]。他们研究了肝素功能化纳米颗粒/纤维蛋白胶复合物负载VEGF，对于血管生成的生物学活性以及治疗效应[16]，根据小鼠皮下埋植模型中毛细血管密度观察，肝素功能化组有显著增加的生物学活性;并且，在小鼠后肢缺血模型中，功能化纳米颗粒复合物明显提高了治疗性血管生成因子的作用，小鼠后肢血压明显恢复，血管生成量和脉络密度有明显增加。

Tan Q等通过物理自组装法制备了一种肝素/壳聚糖纳米颗粒，直径为 67～132 nm。将该载VEGF纳米粒子固定到牛颈静脉脱细胞支架上，观察其对支架的血管化作用[17]。分别用低浓度VEGF组(50 ng/mL)和高浓度 VEGF组(250 ng/mL)评价了支架体内和体外的血管化。该固定了载VEGF肝素/壳聚糖纳米颗粒的支架在体外可持续几周高效缓释 VEGF，30 d内低浓度组 VEGF释放率约为37.12%，高浓度组释放约42.17%，并且明显地刺激内皮细胞的增殖;将这种支架埋植到小鼠皮下，分别于4周和8周取材，组织学分析显示该载VEGF纳米颗粒显著增加了成纤维细胞浸润，细胞外基质的形成，并且在小鼠皮下埋植模型中加速了血管化。这项研究提供了一种新的加速组织工程支架再生的方法，很有应用前景。

采用纳米颗粒载体技术，可以提高VEGF的负载量，颗粒的溶解速率也将随着颗粒尺度的缩小而显著提高。此外，颗粒能将VEGF转运到特定靶位，在病灶处合理释放，提高了VEGF利用率的同时，避免了药物对其他部位的不良刺激，可设计靶向性载VEGF纳米颗粒来治疗特定部位的缺血性疾病。但是单独使用纳米颗粒作为载体，其对VEGF的释放速率较快，几天后就基本完全释放，因此将其与支架或凝胶相结合，也是提高其释放及原位固定效果并使其在组织工程领域有着更为广阔的应用前景。

1.3 VEGF-水凝胶体系

由于水凝胶与很多组织细胞外基质结构相似，可以在相对温和的条件下制备处理，释放传递过程中可减小感染概率，已经被广泛应用作为药物和各类细胞生长因子释放的载体材料。如前所述，它们也常作为基质负载微球来更好地实现VEGF的原位控释，以避免载药微球和纳米粒被巨噬细胞所吞噬。常用的有天然高分子水凝胶包括海藻酸盐、壳聚糖、琼脂糖、胶原、明胶和透明质酸等形成的水凝胶，以及合成高分子水凝胶：聚氧乙烯、聚乙烯醇和聚丙烯酸胶等[7]。

Silva等制备了一种可注射海藻酸盐水凝胶体系[18]。他们通过部分氧化聚合物链和改变聚合物的相对分子质量分布，可以控制海藻酸凝胶的降解速率，从而控制生长因子的释放速率。将该体系注射到缺血部位，可持续释放相对低量的有活性VEGF达15 d，而单纯注射的VEGF在72 h之后全部被清除。小鼠后肢缺血部位的新生血管明显增加;缺血再灌注影像显示注射该水凝胶体系28 d之后，组织的血流灌注已接近正常水平，而单纯注射VEGF组却远远达不到正常水平。表明该可注射降解可控的水凝胶体系能够显著促进治疗性血管新生。

Tabata等研究了胶原凝胶中VEGF的体内释放，用I125标记VEGF包裹于胶原凝胶中，埋植于小鼠背部皮下，胶原凝胶用不同剂量的戊二醛交联不同的时间，随着交联浓度和时间的增加，胶原凝胶的降解速率越慢，VEGF的释放时间也越长;与 VEGF溶液和空胶原凝胶对照组相比，埋植载VEGF的胶原凝胶组周围有更显著的血管新生[19]。

与微球和纳米粒子相比，水凝胶主要通过物理吸附和包裹负载 VEGF，因此通常载药量较低，VEGF易失活，需负载高于微球和纳米粒子的剂量(1～3 μg)，两周左右基本释放，且释放速率较快，一般为两周左右，但是由于其材料的温和性，在体内常用于缺血部位的原位注射以及美容整形的皮下注射。

1.4 VEGF-组织工程支架体系

寻找适宜的方法将生长因子负载于支架材料中，达到缓慢控制释放，防止生长因子从释放部位迅速扩散，达到有效刺激细胞的增殖、分化、生长与组织再生同步的目的，已成为组织工程学的重要研究内容。

采用聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物PLGA等制备的多孔支架，由于其制作过程复杂，大都要用到有机溶剂并需要水溶液后处理。从保持生长因子活性和载药量考虑，很难将生长因子直接加入到聚合物单体原料中共处理。可以将生长因子包埋于疏水性可降解聚合物的微粒中，在多孔支架的制备过程中加入到基质材料中。但这种方法有操作复杂、载药量低、生长因子释放速率不易调控等问题。而利用生物学方法对已成型的多孔支架进行表面处理，将生长因子负载在支架上，不但操作简单，且可以保持生长因子的活性，有一定缓释效果，是目前一种较好的方法。徐晓峰等通过物理吸附的方法将VEGF负载于纳米羟磷灰石胶原(nano Hydroxyapatite/collagen，nHAC)上，制备成VEGF+肝素/纤维连接蛋白(HP/FN)+nHAC缓释支架。经Elisa方法检测，证明了该缓释支架能够延缓VEGF的释放，具有一定的缓释效果[20]。实验中人骨髓间充质干细胞(h MSCs)经诱导为成骨细胞后种植于该缓释支架，通过计算细胞黏附率、支架内的细胞数及扫描电镜观察，证实了 VEGF+HP/FN+nHAC缓释支架无细胞毒性，且更有利于细胞的黏附生长和分化，能使成骨诱导的种子细胞表达更强的成骨能力，表现出优良的生物相容性。

戴建武和Radisic小组则分别用不同的化学方法将VEGF共价固定到多孔的胶原支架上，并都证实了这种共价结合了VEGF的胶原支架能很好的促进血管生成和组织再生[21-23]。例如，Radisic小组将VEGF和血管生成素1(Ang1)共价结合到三维多孔胶原支架上，体外种植内皮细胞，3 d后，VEGF/Ang1修饰支架组的内皮细胞与未修饰支架和游离生长因子对照组相比有明显的增殖，有较高的乳酸生成率和葡萄糖消耗率;7 d后，修饰了生长因子的支架上由内皮细胞生成的管状组织增加，并且内皮细胞的渗透性增强[22]。

孙勇等采用兔桡骨完全性骨缺损模型，将复合有VEGF或骨形态发生蛋白的纳米陶瓷人工骨植入动物骨缺损处，比较其修复骨缺损能力，分析其促进骨生成机制[24]。复合人工骨中含 VEGF约300 ng/cm3，能有效缓释约10 d。在术后8周前，成骨体积、血管数均是复合血管内皮生长因子组＞复合骨形成蛋白组，组织学切片发现在血管长入、骨生成、骨塑型等方面复合VEGF组均略早于复合骨形成蛋白组。证明复合VEGF的纳米陶瓷人工骨修复材料能满足骨组织替代的要求，修复骨缺损的效果确切，其特点是能促进人工骨早期血管化和成骨。

支架材料在固定生长因子方面与微球和纳米粒子类似，载药量相对较高，释放速率也可达到移植部位组织修复的要求，由于支架的稳定性和可加工成型特性，虽然其有效缓释时间不到两周，但其在早期的促血管化作用影响了之后长达数周的血管新生和组织再生，在血管移植尤其是骨组织修复方面有着不可替代的作用。

1.5 VEGF基因载体

为克服单纯蛋白质治疗的缺点，人们考虑应用VEGF基因治疗，即将外源VEGF基因导入目的细胞并有效表达，从而达到治疗目的。

基因治疗需要合适的载体，目前被研究应用最多的是腺病毒载体[25]。腺病毒载体能有效感染多种细胞，不整合入宿主细胞基因组，在增殖缓慢或静止型的细胞中仍可转录，因而得到广泛应用[26]。ZHANG等构建了携带VEGF和骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)的重组腺病毒(adeno-associated virus，AAV)载体，并转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)，7 d后绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表达明显增加，28 d后仍可检测到;在大鼠后肢缺血模型中，GFP的表达从注射后第四周开始增加，在第八周仍可检测到。基因转然后8周，AAV-VEGF/BMP组的平均血流量明显增加[27]。该研究表明：腺病毒载体介导的VEGF和BMP基因转染可刺激血管生成和骨再生，可能为股骨头缺血性坏死的治疗提供新的策略。

由于病毒载体具有潜在的致癌毒性和免疫原性，非病毒载体作为其替代物在基因治疗方面有着较快的发展，非病毒转基因载体能够浓缩质粒，被细胞内吞并进入细胞核，从而使质粒表达它们，且制备简单，费用低，易于大规模生产等，但有转染效率低，一过性表达等缺点。Zhou等以pcDNA3质粒为载体介导VEGF基因转染大鼠MSCs，以缝扎左冠脉前降支起始部方式构建大鼠心肌缺血模型，2周后以心肌内注射方法移植转染VEGF基因干细胞，并设对照组、基因组、干细胞组[28]。4周后以免疫组化染色及测定毛细血管密度检测疗效，结果显示各治疗组不同程度的心功能改善，以转基因干细胞组心功能改善最为显著，心肌梗死范围明显小于其他组。既保证了血管的新生以促进心功能的改善，又不至于引起血管再生的过度或畸形。转染VEGF基因MSCs在抑制心室扩张，限制心室重构及促进心肌细胞修复，缓解心功能进行性下降等方面优于单纯的细胞治疗或基因治疗。

通过载体介导能表达VEGF蛋白的基因，并转染干细胞，可获得局部持续、稳定、高效表达 VEGF蛋白的能力，并且有利于VEGF浓度的精准维持和生理性负反馈调节，因此能更好地调控血管新生的程度，从而加强了转基因干细胞对缺血性疾病的疗效。与传统载体微球、纳米粒子、支架和水凝胶相比，新型的基因载体从根源上解决了VEGF蛋白的来源，在治疗心肌梗死和缺血性坏死方面有着显著的疗效，但其有无长期的副作用还有待进一步的考察。

2 问题与展望

近年来，VEGF缓释体系的研究在取得一定成绩的同时也存在着诸多问题。对于蛋白质药物的传递及缓控释放，高分子微球、纳米颗粒以及水凝胶体系给药方便，且广泛应用。但对于组织修复用各种生长因子，组织工程支架方法则可以达到很好的控释和定位治疗效果且在组织生长方面有很大优势。但是因为需要手术植入而造成创口，为其美中不足。目前很多研究工作者致力于改进载体制备方法，应用不同材料制成混合材料或同时配合微球、水凝胶以及基因载体技术实现其注射方式给药。寻求以复合载体作为解决问题的突破口构建缓释体系，以靶向性高、释药平稳有效、定量准确、有利于组织再生为目的不断改善生长因子缓释体系的制备方法，从而实现VEGF稳定、有效地释放。

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