r DNA-ITS序列鉴定深部真菌菌种的研究进展

仇萌 邹先彪

(解放军总医院第一附属医院皮肤科,北京 100048)

近年来,随着医学技术的飞跃发展,抗生素、免疫抑制剂、皮质类固醇激素在临床得以广泛应用,介入治疗、器官移植、导管插管等技术普遍开展,又因免疫障碍和艾滋病的流行,深部真菌感染呈持续上升趋势,且预后较差,病死率高。引起深部真菌感染的真菌种类很多,临床常见的有念珠菌、隐球菌、曲霉菌、毛霉菌、青霉菌、孢子丝菌等。有报道,念珠菌属的感染在获得性血液感染中已经占第 4位,是院内真菌感染的 78.3%。近年来,曲霉菌感染已经上升到了深部真菌感染的第 2位[1]。深部真菌感染的诊断一直是临床微生物实验室的主要难题,其早期诊断对深部真菌感染的临床结果有着重大影响,在越来越多的耐药菌株出现后,菌种鉴别的重要性已不容忽视。传统的真菌分类方法主要根据真菌的形态学、生理生化特点及生理生化指标来来进行分析,但由于某些真菌属、种之间的形态学或生理生化差异极不显著,且真菌的培养和检出需要特殊培养条件和方法以及多数真菌的生长缓慢等特点的影响,给真菌鉴定工作带来困难。随着 1953年 DNA双螺旋结构的提出,分子生物学检测手段被发现在真菌快速检测和鉴定方面有巨大的潜能,包括多聚酶链式反应(polymerasechain reactions,PCR)、限制性片段长度多态性分析 (restriction fragment length polymorphism,RFLP)、分子杂交及随机扩增多态性分析 DNA(random amplification of polymorphic DNA,RADP)等[2]。目前,这些分子生物学检测方法多聚焦于对 rDNA的内部转录间隔区 (internal transcribed spacer,ITS)序列分析的研究,主要是由于该区域可从不太长的核酸序列中获得相对足够的信息用来研究深部真菌种间及部分种内群体的关系[3]。本文对真菌基因组rDNA的 ITS序列在深部真菌鉴定方面的研究现状作一简要概述。

1 r DNA-ITS的结构及其特点

构成真核生物核糖体的 rRNA由 rDNA编码,rDNA是基因组 DNA中的中等重复、串联排列、并有转录活性的基因家族[4]。rDNA一般由转录区和非转录区构成。转录区包括 5S、5.8S、18S和 28S rDNA,其中 18S、5.8S和 28S rDNA基因组成一个转录单元,产生一个前体 RNA。内转录间隔区ITS1(internal transcribed spacer1)位于 18S和 5.8S rDNA之间,内转录间隔区 ITS2位于 5.8S和 28S rDNA之间,ITS1和 ITS2合称为 ITS。在染色体上ITS可被转录,分开这些重复序列的 DNA片段称为非转录区 (nontranscribed spacers,NTS),在 18SrDNA基因上游和 28SrDNA基因下游的小片段称外转录间隔区 ETS(external transcribed space),NTS和 ETS一起组成基因间隔区 (internal gene spacers,IGS),在转录时有启动和识别作用[5,6]。ITS和ETS包含有 rDNA前体加工的信息,在 rRNA成熟过程中有着相当重要的作用。真菌 rDNA基因组内有 60～200个拷贝,其中 ITS区域长度一般在650～750 bp之间。

2 rDNA-ITS序列分析的应用原理

rDNA上的 18S、5.8S、28SrDNA基因序列进化速率慢且相对保守,存在广泛的异种同源性,其中小亚基 18SrDNA序列常被用来研究属及属以上分类群的演化关系,大亚基 28S rDNA中的 D1/D2区域可用于属及临近等级的分类群[7]。rDNA-ITS由于不加入成熟核糖体,所以受到的选择压力较小,进化速率较快,具有广泛的序列多态性,在其保守性上表现为在种内不同菌株之间高度保守,而在真菌种间差异明显,这种特点使得 ITS适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析[8]。ITS区域相对较短,能够很容易根据其保守区设计通用引物,进行 PCR扩增,且该序列具有重复的多拷贝特性,使 ITS区很容易从少量、稀疏或高度降解的 DNA样品中获得[9]。

3 ITS序列分析的方法学

真菌 rDNA-ITS序列分析用于深部真菌的诊断和鉴定多通过 PCR技术实现。其序列分析方法一般主要有两种方法,即 rDNA序列测定分析法和 RFLP分析法[10]。其中引物设计是 PCR扩增过程的重要步骤,若确定真菌感染,则引物设计依据真菌的保守序列,一般针对核糖体蛋白基因(rDNA)及其内部 ITS,常用引物有 ITS1、ITS1-F、ITS2、ITS3、ITS4、ITS4-B等;若鉴定感染真菌的种类则应根据属种间高变区或特异基因设计特异性引物,直接鉴定至种或群[11]。在研究过程中,在引物引导下,以真菌的核酸为模板,扩增出包括ITS1、5.8S和 ITS2的全长 ITS区域序列,结合DNA序列测定分析和 RFLP分析,进而对真菌进行分类鉴定。

4 ITS序列分析在深部真菌分类鉴定中的应用

由于 rDNA-ITS序列能准确快速地反映出属间、种间以及菌株间的碱基对差异,目前已越来越广泛地应用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育研究中。其中研究最多的是念珠菌属和曲霉属。Bobby等[12]使用焦磷酸测序技术 (pyrosequencing strategy)对 60株念珠菌属菌株进行 ITS2序列扩增后进行菌种鉴定,结果 C.albicans,C.dubliniensis,C.glabrata,C.guilliermondii,C.krusei,C.lusitaniae,C.parapsilosis,and C.tropicalis均被正确检测出,结果与生化检测和形态学鉴定的结果一致,且检测时间 (6 h)远远小于生化检测 (26 h)和形态学鉴定 (82 h)所需时间。Adam等[13]使用核糖体 ITS区及大亚基 D1/D2区测序法从 1位真菌性腹膜炎患者的腹水中分离出Candida subhashii。Yong等[14]报道曾在两名白血病患者血液中分离出一种罕见念珠菌菌株,经常规培养和生化试验鉴定为 C.parapsilosis,而通过真菌特异性寡核苷酸引物 ITS1和 ITS4对该菌株进行 PCR扩增,并将 PCR产物纯化及使用 BLAST和CLUSTAL序列分析软件进行序列测定,最终鉴定结果为 Candida orthopsilosis(为 C.parapsilosis的一个亚种,在形态上与 C.parapsilosis难以鉴别)。Aspergillus flavus,A.fumigatus,and A.terreus是侵袭性曲霉病的 3种主要致病菌,其侵袭力、病死率及对抗真菌药物的敏感性差异较大,从种的水平上进行鉴别尤为困难。Henry等[15]应用 ITS1和 ITS4两种引物对 11份临床标本进行了双盲试验,对曲霉的这 3种致病菌种进行了鉴定,PCR方法与形态学方法取得了较好的一致性。美国学者 Hans等[16]分别使用核糖体大亚基 D1-D2区、ITS1区、ITS2区对曲霉菌属的 Aspergillus fumigatus、Aspergillus flavipes、Aspergillus flavus等 13个菌种进行鉴定,使用 DNA序列比对及双核苷酸比对法后显示 D1-D2区序列种间序列差异为 91.9%～99.6%,ITS1区种间序列差异为 57.4%～98.1%,ITS2区为 75.6%～98.3%。使用 GenBank数据库数据分析显示对于亲缘关系较近但不同的菌种,13个菌种中有 10个菌种在 D1-D2区上表现出小于 1的核苷酸歧异度,而仅有 5个菌种在 ITS1或 ITS2区表现出小于 1的核苷酸歧异度,由此可见,ITS区在种水平上有更强的鉴别力。ITS区除了广泛应用于念珠菌属及曲霉菌属种的水平上鉴定以外,近年来,也有不少学者逐渐将其用于隐球菌属、孢子丝菌属的种间及菌株间鉴定。Masakazu等[17]联合使用 PCR指纹技术及 RAPD技术对来自于日本和澳大利亚的 96株新生隐球菌菌株的 ITS区进行序列分析,并明确地将新生隐球菌鉴定至变种水平。Watanabe等[18]曾对 12个国家的临床标本中分离的 204株申克孢子丝菌的 ITS1、5.8SRNA基因和ITS2区测序分析,发现在各株之间碱基对差异一般是 8个以内,最大差异率是 3.2%,而在申克孢子丝菌和 Ceratocysis stenoceras之间碱基对的差异率是 10%以上。

在国内的研究中,ITS序列在深部真菌的鉴定方面也取得了很大的进展。王英等[19]应用两对ITS1、ITS4和 ITS86、ITS4通用引物对 7种 (8株)念珠菌进行 PCR扩增,结果为 3.5 h内对 7种念珠菌的菌悬液扩增出种特异的 DNA条带,证明 ITS序列可以快速准确地应用于念珠菌属种间鉴定。骆志成等[20]在国内首次对烟曲霉 rRNA基因内转录间隔区进行克隆测序分析,结果显示,烟曲霉rRNA基因的 ITS1、ITS2区均十分保守。与黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等比较,均有一定程度的差异,这说明其种间 ITS区序列变异大于种内变异。窦红涛等[21]将受试镰刀菌接种于 PDA培养基,观察其菌落及镜下形态,在此基础上 PCR扩增受试镰刀菌的 rDNA ITS并测其序列,在 GenBank核酸序列数据库进行同源序列搜索及分析。形态学鉴定结果显示,茄病镰刀菌所占比例最高,除 2株串珠镰刀菌外,其余镰刀菌 ITS序列分析的结果与形态学鉴定结果一致。茄病、层生和串珠镰刀菌的 Dra II、Cfr13 I酶切带形互不相同。用 Sol1、Sol2扩增受试菌的 rDNA ITS,只有茄病镰刀菌为阳性。提示 rDNA ITS序列测定及其 PCR-RFLP可用于初步鉴别几种临床常见镰刀菌,合适的种特异性引物可以初步快速鉴定茄病镰刀菌。王永晨等[22]从疑似申克孢子丝菌感染患者的感染部位表面刮取物、腐烂组织或活检组织中提取 DNA,并应用合成的申克孢子丝菌特异性引物 1TS3-SSP进行核糖体DNA内 ITS2靶序列 PCR扩增,结果示在 17例经形态学检查和真菌培养检查证实的组织标本中,有12例扩增出 191 bp的片段,其中 7例组织中发现染成紫红色的圆形或卵圆形的孢子。陈敏等[23]采用真菌通用引物 ITS1、ITS4对 12株新生隐球菌不同变种标准株的 ITS片段进行 PCR扩增和测序,结合基因库等数据库中 11株新生隐球菌标准株的ITS序列进行比对,发现新生隐球菌变种之间 ITS序列存在明显差异,存在 6种亚型;格特隐球菌 ITS序列存在 4种亚型。中国发现的原新生隐球菌上海变种 s8012与格特隐球菌在表型及分子生物学研究均存在显著的差异,但仍属于变种内差异。最终将我国发现的上海变种 s8012归入格特隐球菌的 ITSC型,原格特隐球菌 RV20186归入格特隐球菌的 ITSF型。

5 r DNA-ITS序列分析法鉴定深部真菌的应用前景与展望

深部真菌的诊断对于患者的治疗和预后起着决定性作用。rDNA-ITS序列分析法不仅丰富了真菌核糖体基因 ITS的序列信息,为真菌的分类鉴定及系统发育等研究提供了十分重要的依据,而且为建立病原菌的分子检测与疾病的快速诊断技术奠定了基础。

rDNA-ITS序列分析与传统的真菌形态学鉴定方法相比较,受主观经验与实验条件的影响较小,而且快速简便。但 ITS区域也不是能对所有真菌的属种或组群进行鉴别,分析结果可能会受到比对使用的基因库完善程度的影响。因此,在基因库中存在的、与待检真菌亲缘关系相近的已知真菌序列缺乏时 ITS序列分析的应用能力就受到一定的限制。另外,有的真菌由于进化顺序、变异,甚至分析方法等原因,在间隔区上表现的差异性较小,不适合于属内种及种群的标记;而且真菌的不同地理、不同寄生宿主型别的鉴定上也存在困难。以镰刀菌为例,ITS序列对镰刀菌种间水平上的分子鉴定是可行的,但镰刀菌种内群体水平在该区域上遗传变异并不明显,可能没有差异或差异非常微小,使得 ITS区不适宜于镰刀菌专化型或生理小种间的分类研究。近年来,随着一些全新的 DNA测序方法,如杂交法、质谱法、原子探针法、流动式单分子荧光检测法、超薄水平凝胶电泳技术等逐渐应用到 ITS序列分析中以及生物信息学的不断完善[24],相信 rDNA-ITS列分析的应用将会有更大的发展空间。

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