内毒素致多脏器功能障碍综合征绵羊模型的建立

王春雨，凡春玲，罗晓红，万东君，李 晶，陆 璐，王红义，牛廷献

（兰州军区兰州总医院 1.内分泌科，2.干部病房，3.动物实验科，兰州 730050）

多脏器功能障碍综合征（MODS）多继发于严重感染、创伤、内毒素血症等，治疗难度大，死亡率高，国内外迄今没有突破性进展。由于其原发病因各异、发病过程不同，发病机制复杂，加之治疗因素的干扰，使得难以全面细致观察MODS患者病情变化的全过程。MODS动物模型是研究其发病机制和临床防治的基础，因此，建立简单有效且符合临床实际的MODS动物模型一直是是国内外研究的难点和热点。本研究利用LPS诱发绵羊脓毒血症，进而介导MODS，以探讨建立一种简单有效且能模拟MODS病理和临床特征变化的动物模型。

1 材料和方法

1.1 动物与分组

12只1年期健康杜泊绵羊，雌雄各半，随机分为实验I组和II组，每组各6只，平均体重（18.4±3.5）kg。全价饲料饲养。

1.2 模型建立

实验组动物均用速眠新Ⅱ号（1.5mL/kg）（军事医学科学院军事兽医研究所，吉兽药试字（2004）005013）肌内注射麻醉。之后，实验I组和II组分别以3μg/kg和6μg/kg LPS［1］（血清型为：O127：B8，批号为64H4010，美国Sigma公司）于30min和60min内均匀持续经前肢桡静脉泵入。

1.3 检测指标与方法

血气、血常规和血清生化等指标的检测均由本院检验科测定。

1.3.1 血气分析：LPS静注前后，分别于0、1、2、3和6h经股动脉采血，立即测定氧分压（PaO2）。

1.3.2 血常规和血清生化指标的测定：LPS静注前后，分别于0、3、6、12、24、48和72h经颈静脉采血，分别测定血常规、生化指标（天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、总胆红素（TBIL）和肌酐（CRE））。

1.4 MODS的诊断标准

参照胡森等［2］提出的动物发生MODS时各个器官功能障碍分期诊断标准和评分标准。在注射LPS后出现2个或2个以上器官或系统功能障碍判定为MODS。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 体征表现及死亡率

两实验组绵羊静脉泵入LPS 2h后，呼吸加快且困难，心率快而不齐。7h后腹胀，尿频，不能站立，运动障碍。24h后实验Ⅰ组2只和Ⅱ组3只绵羊因呼吸窘迫、心律失常、血压下降，继而心衰而死亡，死亡率分别为33.3％和50％。

2.2 气血分析

静注LPS后，1～6h实验Ⅰ组和Ⅱ组绵羊股动脉氧分压（PaO2）（mmHg）与0h相比均明显下降（P＜0.01），氧合指数［PaO2/FiO2（吸入氧浓度）］均≤26.70kPa（1kPa=7.5mmHg）（表1）。结果表明，氧合指数已达到急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的诊断标准［3］。

2.3 血清生化指标的变化

表1 两实验组气血分析Tab.1 Blood gas analysis in the two groups

静注LPS前后结果表明（表2）：①AST：两实验组均在6h时开始上升，12h～72h的水平明显或显著高于0h（P＜0.05或P＜0.01）。实验I组在24h时达到峰值，而实验II组从6h开始以极高的水平不断上升，直至72h。②ALT：两实验组均在24h的水平达到峰值，之后逐渐下降，但明显高于0h的水平（P＜0.05或P＜0.01）。③TBIL：实验I组的水平在12h和24h时明显高于0h（P＜0.05），在24h时达到峰值，之后不断下降。而实验II组12h～72h的水平明显或显著高于0h（P＜0.05或P＜0.01），且保持不断上升。④CRE：两实验组均在24h的水平达到峰值。但实验I组只在24h时的水平明显高于0h（P＜0.05），而实验II组12h、24h和48h的水平均明显或显著高于0h（P＜0.05或P＜0.01）。以上结果表明，静注LPS 24h后成功建立了MODS模型。

表2 两实验组血清生化指标的变化Tab.2 The changes of serum biochemical indexes in sheep of the two groups

2.4 血常规的变化

血常规结果表明（图1），静注LPS后，实验Ⅰ组2h～4h WBC的数目与0h相比明显下降（P＜0.01），12h时开始上升，至48h～72h又明显高于0h（P＜0.05或P＜0.01）。实验Ⅱ组2h～12h WBC的数目明显下降（P＜0.01），24h时开始上升，72h又明显高于0h（P＜0.05）。

图1 两实验组WBC的变化趋势Fig.1 The changes of WBC counting in the two groups

3 讨论

脓毒血症是一个相当复杂的病理生理过程，有其特殊的血流动力学特征，还存在失控的炎症反应、持续高代谢以及最终出现多器官功能障碍综合征（MODS）等特点［4，5］。一般认为，感染后器官功能障碍分为2类［6］：一类为原发性器官损伤（临床称单相速发型），占10％～20％，患者受到严重创伤感染和休克时可以很快发生器官功能障碍；另一类是继发性器官损伤（双相迟发型），占70％～80％，创伤、休克等作为第1次打击，其后感染或非感染性损害构成第2次打击诱发了全身炎症反应（SIRS）或脓毒血症（sepsis），此即二次打击模型。很多学者认为二次打击模型（既双相迟发型）能够更好的模拟人体内疾病的发生和发展过程，但此类模型制作复杂，复制困难。内毒素介导的MODS模型具有致伤因素单一、造模方法简便快捷、结果便于分析等优点。大小鼠、兔、绵羊和犬等动物均可用于建立MODS模型［7-10］，大鼠、小鼠虽然价格低，但对内毒素敏感性较差，解剖结构与人差别较大；兔对内毒素敏感性强，死亡率过高；小香猪模型接近人的发病过程，但成本过高；绵羊与其他动物比较，对LPS敏感性较高，在小剂量LPS作用下就能诱发SIRS，继而进展至MODS［11］；另一方面，绵羊为大型动物，便于实验观察血流动力学、氧代谢和肺机械力学的改变，而且其病理生理变化与人相近［12］。因此，本研究选择静脉泵入小剂量LPS建立绵羊MODS模型。

本研究结果表明，静注LPS后，1～6h实验I组和II组PaO2均明显下降（P＜0.01），氧合指数已达到急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）的诊断标准；AST、ALT、TBIL和CRE两实验组均在不同时点明显或显著升高（P＜0.05或P＜0.01），但AST升高的时间较早（6h）。这表明在MODS的形成过程中，LPS对肝脏的损伤早于心脏和肾脏。血常规结果表明，静注LPS后，两实验组WBC数目在2h时均显下降（P＜0.01），之后又明显升高（P＜0.01）。此结果与有关文献报道一致［13，14］。这提示LPS静注后，首先对WBC具有急剧杀伤的作用，之后形成SIRS，使得WBC数目急剧升高。上述结果表明，本研究利用两种剂量的LPS均成功建立了MODS模型。但两实验组的结果表明，6μg/kg的LPS对机体的损伤程度和死亡率大于3μg/kg。因此，作者认为，若对MODS的发病机制研究，利用3μg/kg的LPS较理想。这样，既节约时间，又节省试剂。若对MODS的干预研究，利用6μg/kg的LPS较理想，这样可以更好地验证药物的防治效果。

［1］郭凤梅，邱海波，周韶霞，等.急性呼吸窘迫综合征绵羊模型的建立［J］.中国危重病急救医学，2001，13（2）：95-98.

［2］胡森，盛志勇，周宝桐，等.双相迟发多器官功能不全综合征（MODS）动物模型的研究［J］.中华创伤杂志，1996，12：102-106.

［3］Beruard GR，Artigas A，Brigham K L，et al.The American-European Consensus Conference on ARDS：definitions，mechanisms，relevant outcomes，and clinical trial coordination［J］.Am J Respir Crit Care Med，1994，149：818-824.

［4］Pellegrini JD，Decoilgen D，Pugana JC，et al.Relationships between lymphocyte apoptosis and anergy following trauma［J］.Surg Res，2000，88（2）：200-206.

［5］Bruins MJ.Aspects of organ protein，amino acid and glucose metabolism in a porcine model of hypermetabolic sepsis［J］.Clin Sci，2003，104（2）：127-141.

［6］孙宇，陆江阳，王晓虹，等.小鼠迟发型多器官功能障碍综合征模型复制及病理学观察［J］.中国危重病急救医学，2003，15（1）：15-18.

［7］段绍斌，李学雄，姚华，等.多器官功能障碍综合征时血管内皮细胞损伤的研究［J］.新疆医科大学学报，2010，33（3）：271-274.

［8］卢瑗瑗，尹文，虎晓岷.家兔失血性休克并内毒素诱发多器官功能障碍综合征模型制备［J］.江苏医药，2005，31（6）：448-450.

［9］任添华，牛驰，任爱民，等.MODS动物模型组织氧代谢的变化特征［J］.首都医科大学学报，2008，29（3）：308-310.

［10］Nolan B，Collette H，Baker S，et al.Inhibition of neutrophil apoptosis after severe trauma is NF kappabeta dependent［J］.Traum，2000，48（4）：599-605.

［11］胡森，盛志勇，周宝桐.MODS动物模型研究进展［J］.中国危重病急救医学，1999，11（8）：504-507.

［12］Mustered RA，Fisher J，Hayman S，et al.Cardiopulmonary response to pseudomonas septicemia in swine：an improved model of the adult respiratory distress syndrome［J］.Lab Animal Sci，1989，39（1）：37-43.

［13］任添华，姜悦，任爱民，等.单相速发型多脏器功能障碍综合征动物模型的研究［J］.首都医科大学学报，2005，26（4）：479-481.

［14］平易，刘骏峰，谢琼红，等.内毒素介导的多脏器功能障碍综合症动物模型的研究［J］.中国临床医学，2009，16（2）：287-290.