格林-巴利综合征脑脊液蛋白质组学的研究进展

金 涛 孙 莉 张 颖 (吉林大学第一医院神经内科，吉林 长春 130021)

格林-巴利综合征(Guillain-Barre Syndrome，GBS)是一种急性炎症性自身免疫性周围神经病，以周围神经和神经根脱髓鞘、轴索变性及小血管周围淋巴细胞和巨噬细胞浸润所致的炎性反应为主要病理特点。目前，GBS的病因及发病机制尚未完全阐明，临床上也缺乏特异有效的治疗手段，但鉴于大多认为本病是由细胞免疫和体液免疫共同介导的一种自身免疫性疾病，故采取有针对性的免疫治疗可通过抑制自身免疫反应，减轻神经损害、促进神经再生〔1〕。糖皮质激素具有抗炎及免疫抑制作用，在GBS的治疗中曾广泛使用;但资料显示常规激素治疗并不能阻止GBS病情发展及缩短病程，而且会增加激素治疗引起诸多副作用的风险，故现已不推荐用于GBS的治疗〔2〕。血浆置换(plasma exchange，PE)是最早证实对GBS有效的免疫治疗，可去除患者血浆中的抗体、免疫复合物、炎性介质等致病物质，从而减轻对周围神经的损伤，达到延缓GBS病情进展及缩短病程的作用〔3〕;但是，PE治疗需要特殊设备，技术要求高，且为有创治疗，临床应用受到很大限制。静脉注射免疫球蛋白(IVIG)疗法，由于其免疫替代及免疫调节的双重作用，能够增强机体的抗感染能力，明显有利于神经功能的恢复〔4〕，但是，IVIG价格昂贵，而且存在血制品应用的一系列风险。总之，目前以GBS发病机制为依据所进行的免疫治疗，疗效尚不够稳定，个体差异悬殊，预后也很难估计，使GBS的医疗救治工作面临很大的困难。

1 蛋白质组学简介

近年来，蛋白质组学的发展日新月异，正越来越广泛的应用于科学研究及临床工作中。广义上讲，蛋白质组(Proteome)是指“一种细胞、组织、体液或完整的生物体所拥有的全套蛋白质”〔5〕。蛋白质组学(Proteomics)则是以蛋白质组为研究对象，大规模、有系统地研究蛋白质的特征及结构，包括蛋白质的表达水平、氨基酸序列、翻译后修饰及蛋白质间的相互作用等，从而在蛋白质水平上研究生物体的各种生理生化过程以及疾病的病理过程〔6〕。目前蛋白质组学的基本技术是利用双向电泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)对全部蛋白质进行分离，然后通过质谱等技术对蛋白点进行鉴定。运用蛋白质组学研究技术，比较病变组织(细胞或体液)与其起源的正常组织(细胞或体液)或疾病发展不同阶段组织中蛋白质在表达数量、表达水平和修饰状态上的差异，可以发现与病变相关的特异蛋白质，它们不仅可为研究疾病发病机制提供线索，而且可作为疾病诊断和治疗的生物标志物〔7〕。

2 脑脊液(CSF)蛋白质组学的特性

在神经科学方面，蛋白质组学的研究已广泛应用于脑组织及细胞培养中，但是，有关CSF蛋白质组学的研究目前才刚刚起步。脑组织检测通常只能在死后进行，即使是脑组织活检因为其可创性也很难开展，而CSF在临床上可较易获得，是中枢神经系统疾病蛋白质组学研究的良好材料;而且，由于CSF与脑组织细胞外液直接相通，其化学成分与脑的细胞外液成分相似，并可与脑之间蛋白质和多肽类物质自由交换，CSF成分的变化和中枢神经系统微环境的变化密切相关，通过CSF蛋白质组学研究，可保证在对患者不造成伤害的情况下，获得大量神经系统疾病信息〔8〕。

但是，CSF蛋白质组学的研究在样品处理上存在着与其他组织和细胞所不同的自身特点:首先，CSF中盐的成分含量很高，大于150 mmol/L，在双向电泳前必须被去除或者显著降低其浓度，因为高盐成分所携带的高电流会干扰蛋白质的电泳分离从而降低双向电泳的蛋白质分离效率。样品溶解后，水化液中盐浓度应控制在10 mmol/L以下，因此在双向电泳前应去除80%的盐分〔9〕。其次，CSF中蛋白质的含量相当低，与血液中蛋白质含量之比大约是4×10－3，仅为200～700 μg/ml，因此，在双向电泳上样前，CSF中的蛋白质必须经过浓缩。而且，CSF中白蛋白的含量约占CSF总蛋白的50%以上，免疫球蛋白占15%以上，高丰度蛋白的出现大大干扰了低丰度蛋白的检出率，而与很多疾病相关的蛋白恰恰又是一些低丰度蛋白质，因此，在双向电泳前，如何对CSF蛋白质进行预分馏就成为富集低丰度蛋白质的关键问题〔10，11〕。

3 CSF蛋白质组学在神经系统疾病中的应用

目前主要集中在以下几个方面:Hammack等〔12〕通过蛋白质组学的方法对比测定了3例多发性硬化(Multiple Sclerosis，MS)患者和3例非MS炎性中枢神经系统疾病患者的CSF蛋白质的表达情况，发现软骨酸性蛋白(CRTAC-IB)、血浆酶原结合蛋白(tetranectin)、钙结合细胞信号糖蛋白(SPARC-like protein)和磷酸二酯酶(autotaxin t)在MS组CSF中的异常表达，推测以上4种差异蛋白的表达可能与MS的发病机制有关;2003年，Puchades等〔13〕对老年性痴呆(Alzheimer＇s Disease，AD) 患者CSF进行了蛋白质组学的研究，结果发现载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白 E(ApoE)、载脂蛋白 J(ApoJ)、β-微量蛋白(beta-trace)、视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein)、激肽原(kininogen)、α-1抗胰蛋白酶(alpha-1 antitrypsin)、细胞周期程序蛋白8(cell cycle progression 8 protein)及α-1β糖蛋白(alpha-1beta glycoprotein)在AD组CSF中异常表达，为AD发病机制的研究提供了新方向;Unlu等〔14〕检测了3例伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性遗传性脑动脉病 (cerebral autosomal dominant arteriopathy with subcortical infarcts and leukoencephalopathy disease，CADASIL)患者和6例对照患者的CSF蛋白质组，通过双向电泳和质谱鉴定发现在CADASIL组CSF中补体因子B(complement factor B)的表达异常增高，提示补体途径可能参与CADASIL的病理机制;2006年，Li等〔15〕对15例特发性正常压力性脑积水(idiopathic normal pressure hydrocephalus，INPH)和12例对照患者的CSF进行了比较蛋白质组学的研究，结果发现在INPH组CSF中富亮氨酸α-2-糖蛋白(leucine-rich alpha-2-glycoprotein，LRG)、α1-抗靡蛋白酶(alpha1-antichymotrypsin)、载脂蛋白 D(ApoD)、ApoJ、结合珠蛋白-α1(haptoglobin alpha1)、血浆白蛋白(serum albumin)和α1-微球蛋白(alpha-1-microglobulin)的表达异常，而且经ELISA检测进一步证实了LRG在INPH组CSF中显著增高，从而提示LRG可能成为INPH诊断和治疗的特异性标记物;2006年，Pasinetti等〔16〕通过蛋白质组的方法在肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)患者CSF中研究发现半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin C)及神经分泌蛋白血管生长因子(VGF)的表达降低，提出CSF中cystatin C及VGF的下降有望为ALS的鉴别诊断提供客观的生物标记。

4 GBS CSF 蛋白质组学

长期以来，CSF蛋白总量的增加一直是GBS的典型特征，在GBS发病的最初，CSF的常规生化检查通常是正常的，但是在发病1 w以后，CSF中蛋白质的含量逐渐增加，甚至高于正常的数倍至数十倍，这一特征性的改变，现已成为临床上诊断GBS的一个可靠指标〔17〕。80年代以来，国内外学者在GBS患者CSF蛋白质方面做了大量研究，Petzold等〔18〕发现GBS患者CSF中病理性升高的神经丝(neurofilament)蛋白可能预示患者运动功能恢复不良;Yonekura等〔19〕发现在GBS患者CSF中抗热休克蛋白的抗体(anti-heat shock protein antibodies)的升高。但是，有关GBS患者CSF蛋白质的研究一直是针对单一或少数几种蛋白质的分割式研究，有关GBS患者CSF蛋白质组学的整体研究目前仍较少见。

本文前期研究〔20〕首次应用差异凝胶双向电泳(2-D DIGE)结合基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)，通过蛋白质组学研究方法对GBS患者CSF进行了整体分析，并且首次报道了GBS患者CSF中存在6种差异蛋白，分别为:结合珠蛋白(haptoglobin，Hp)、ApoA-IV(Apolipoprotein AIV，ApoA-IV)、蛋白2044(未命名蛋白)及转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)、ApoE、纤维蛋白原(fibrinogen，Fg)。其中，Hp、ApoA-IV及蛋白2044在GBS组CSF中显著增高，而TTR、ApoE及Fg则明显降低。几乎同期，德国Ulm大学的Lehmensiek等〔21〕也发现了GBS患者GSF中的Hp、丝氨酸/苏氨酸激酶 10(serine/threonine kinase 10)、α-1-抗胰岛素(α-1-antitrypsin)、癌相免基因(SNC73)、α-II-血影蛋白(alpha II spectrin)、免疫球蛋白G kappa链(IgG kappa chain)、组织蛋白酶D前蛋白(cathepsin D preprotein)表达上调，而转铁蛋白(transferrin)、caldesmon、肠相关淋巴组织(GALT)、人类热休克蛋白70(human heat shock protein 70)、心脏淀粉样蛋白127aa肽段(amyloidosis HL-heart-peptide 127aa)、TTR表达下调。2010年，意大利科学家D＇Aguanno等〔22〕发现GBS患者GSF中一些炎症相关蛋白如维生素D结合蛋白(vitamin D-binding protein)、β-2-糖蛋白I(beta-2 glycoprotein I，ApoH)及补体C3的水平升高，而TTR、ApoE、白蛋白及其5种组分水平下降，并发现GBS患者CSF中的白蛋白及α-糖蛋白对羟基化作用的敏感性增加，而且CSF中IgM选择性增加了对羟基化Fab的反应，说明氧化应激可能参与了GBS的免疫病理机制。2008年，山东大学的杨银荣等〔23〕发现GBS患者脑脊液中的cystatin C表达下调。

5 展望

虽然蛋白质组学的出现为GBS患者CSF的研究提供了有利的手段，但是截至目前，有关GBS CSF蛋白质组学的研究还停留在发现科学上，即发现了哪些差异表达的蛋白，是含量增高了还是降低了，而具体是否与GBS的发病相关，即差异蛋白在GBS发病中的作用尚未阐明。而且在GBS发病过程中，血浆中的蛋白质很可能通过破坏的血神经屏障泄漏进入CSF，这将会在一定程度上影响CSF蛋白质组学的发现。因此在将来的实验中，有必要对所发现的差异蛋白的CSF蛋白质指数测定(计算公式:CSF蛋白质指数=proteinCSF/proteinserum:albuminCSF/albuminserum)，可明确CSF中这些差异蛋白质的来源，即是来源于血浆还是鞘内合成。同时，需深入研究差异蛋白与GBS疾病发病机制之间的关系，期望找寻到GBS的特异性诊治靶点。

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