促红细胞生成素对低氧状态下神经干细胞损伤的保护作用

姚 敏 陈 维 (吉林大学中日联谊医院，吉林 长春 130033)

神经干细胞(neural stem cell，NSC)是具有多种分化潜能的神经前体细胞，NSC移植技术对治疗多种神经系统疾病有着广泛的前景。近年来，国内外学者研究发现，促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)除调控红系祖细胞增殖、分化及成熟外，还与中枢神经系统的生长、发育密切相关。本实验旨在研究低氧环境下，EPO对NSC缺氧性损伤的保护作用，为NSC移植技术最终应用于临床提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM/F12培养基(Gibco公司)、胎牛血清(FBS，杭州四季青生物技术有限公司)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Pepro Tech公司)、表皮细胞生长因子(EGF，Sigma公司)、EPO(武汉原生原代生物医药科技有限公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT)及二甲基亚砜 (DMSO，Sigma)，Anti-Nestin兔抗多克隆抗体及Anti-EPO兔抗多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 NSC分离培养及单细胞克隆的制作 实验大鼠均为吉林大学实验动物中心提供，37℃环境中，无菌条件下取出孕龄11.5天大鼠的胎鼠脑组织剪碎，加入0.25%胰蛋白酶消化10 min，过滤采用120目铜网，去除组织纤维，加入浓度为20 ng/ml的EGF以及20 ng/ml的bFGF组成的生长培养基，离心后去除上清液以获取单个细胞悬液，活细胞密度调整至1.0×105/ml，接种于培养瓶中，第1次换液于24 h，以后每2日换液1次，培养5～6 d，克隆形成后制成单细胞悬液，以细胞密度为1.0×105/ml进行传代，以此方法传代3次即传至P3，P3代液体离心后取NSC。

1.2.2 NSC的鉴定 选用P3代单细胞克隆球进行Nestin免疫细胞化学染色，结果显示Nestin表达呈阳性，神经细胞球内细胞质均呈棕褐色;诱导分化后分别进行神经元特异性烯醇化酶(NSE)及胶质纤维醇性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色，NSE表达阳性。GFAP免疫细胞化学染色见细胞质及突起呈棕褐色，胞体较大、突起粗而短。

1.2.3 实验方法 在三气培养箱中，实验环境分别设置为常氧环境及低氧环境，温度均为37℃，培养120 h。通过调节N2浓度而设定O2的浓度为5%，选用P3代克隆干细胞单细胞悬液，实验组将NSC接种于含 EPO的浓度为50 U/ml的培养基中，同时设含等量的NSC且不含EPO的对照组。每日观察NSC的分化情况。

1.2.4 检测方法

1.2.4.1 MTT法检测 以每孔约1.0×104个细胞密度接种于96孔培养板中，100 μl/孔。于37℃、5%CO2孵箱中培养过夜。待细胞贴壁后弃上清液。取10 μl溶于磷酸盐缓冲液(PBS)的MTT(5 mg/ml)加入每孔，然后在37℃孵箱中孵育4 h，将孔内溶液弃掉，加入DMSO每孔100 μl，轻轻震荡10 min以终止反应并充分溶解甲臜颗粒。用酶标仪570 nm处测吸光度(OD)值。实验重复3次，每次实验中相同条件设6个平行孔。

1.2.4.2 免疫荧光染色及计数 将干预后的细胞分别接种于6孔培养板中，每孔接种50个神经球，常规处理后，分别做NSE、GFAP免疫荧光染色，倒置荧光显微镜普通光路及488 nm波长光路下计数每个视野下的细胞总数和阳性细胞数，求出阳性细胞数的百分率，取平均值。

1.3 统计学分析 应用SPSS10.1统计软件进行处理，数据资料以±s表示，组间比较用t检验。

2 结果

各组细胞经过5 d培养，常氧组、对照组、实验组的细胞克隆形成率(%)分别为 30.37±4.34、42.82±5.25、70.14±5.52，实验组明显高于对照组(P＜0.01)。常氧组、对照组、实验组的 NSC的分化比率(%)分别为32.5±4.2、47.2±5.1、72.8±5.8，对照组与实验组比较有显著性差异(P＜0.05)。

3 讨论

EPO 是一种含唾液酸的酸性热稳定糖蛋白，近年来国内外学者研究表明EPO及其受体广泛存在于人和动物体内多种组织和器官中。EPO与神经系统的生长、发育密切相关，尤其是对发育中的中枢神经系统具有保护作用，并可提高神经的再生与修复〔1〕。EPO可促进脑组织在缺氧状态下血管内皮细胞的分化，因而可改善缺血部位的供血及营养的供应，NSC与缺氧的程度成正比，缺氧剂量越高，凋亡细胞的数量越多〔2〕。EPO还可作为神经分化因子，影响神经细胞的分化及再生，并可促进NSC分化为多巴胺能神经〔3〕。本研究取鼠胚脑源性神经细胞进行传代克隆，在低氧环境中分别设立实验组及对照组，实验组接种于含EPO的培养基中，对照组与实验组的细胞克隆形成率(%)分别为42.82±5.25、70.14±5.52，实验组明显高于对照组(P＜0.01)，表明EPO对低氧环境中的NSC有促进分化及抑制凋亡的作用。国内学者赵保明等〔4〕的实验结果支持了本结论。本实验的分化培养中，实验组显示神经球贴壁较快，周围伸出突起早，培养24 h左右观察到细胞从神经球中迁出，2 d后见突起互相交织，3 d后即形成密集的网络样结构。P3代神经球Nestin实验呈阳性反应，诱导分化后部分神经干细胞NSE实验阳性，部分GFAP实验阳性，说明培养出来的NSC有分化为神经元和星型胶质细胞的能力。经免疫荧光染色及计数方法测得实验组中的 NSE阳性细胞数最多，高于常氧组及对照组(P＜0.05)。EPO直接作用于大鼠的鼠胚内皮细胞，使其分泌脑源性神经营养因子，该物质可以促进NSC的增殖和分化〔5〕。EPO与EPO受体结合后，改变后者的构象，激活了蛋白酪氨酸激酶，使神经细胞内多种蛋白质酪氨酸磷酸化，启动信号转导通路，从而控制 NSC的增殖和分化，抑制其凋亡〔6，7〕。实验中的bFGF和EGF作为重要的有丝分裂原，在机体细胞的生长、发育以及受损组织的修复过程中起到重要的作用，二者对培养基中的NSC的生长具有很强的促进作用。Eisen等〔8〕认为，EPO不仅对NSC的缺氧性损伤有保护作用，对于其他形式的伤害同样也具有保护作用。

总之，EPO作为新的神经营养因子，对缺氧的胚鼠脑源性NSC有营养和保护作用，刺激神经祖细胞的分化及增殖，阻止其凋亡，为EPO治疗人类中枢神经系统损伤和退行性变提供了新的实验基础。

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4 赵保明，赵 莉，耿慧慧.促红细胞生成素对低氧状态下神经干细胞增殖、分化的影响〔J〕.蚌埠医学院学报，2010;35(1):4-9.

5 Wang L，Zhang Z，Wang Y，et al.Treatment of stroke with erythropoietin enhances neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function in rats〔J〕.Stroke，2004;35(7):1732-7.

6 Chang YC，Huang CC.Perinatal brain injury and regulation of transcription〔J〕.Curr Opin Neurol，2006;19:141-7.

7 Zhao W，Kitidis C，Fleming MD，et al.Erythropoietin stimulates phospho-rylation and activation of GATA-1 via the PI3-kinase/AKT signaling pathway〔J〕.Blood，2006;107(3):907-15.

8 Eisen A，Fisman EZ，Rubenfire M，et al.Ischemic preconditioning:nearly two decades of research.A comprehensive review〔J〕.Atherosclerosis，2004;172(2):201-10.