诱导型一氧化氮合酶的调控机制及其抑制剂的研究进展Δ

杨晓露，章丹丹，唐 宁，华晓东，卞 卡（上海中医药大学穆拉德中药现代化研究中心，上海市201203）

一氧化氮（NO）作为一个心血管信号分子，在20世纪80年代首次被Murad等研究小组发现，Murad等3位主要研究者因此而获得1998年诺贝尔生理学和医学奖。经过多年的研究，现发现经由诱导型一氧化氮合酶（iNOS）产生的高浓度NO与炎症关系密不可分，是炎症作用机制中重要的细胞内信使和分子标志物。过量的NO将导致细胞损伤、组织坏死，进而促进炎症性疾病的发生、发展。iNOS的调节机制涉及多条信号通路及其交汇作用，这些通路中的关键分子作为中药源炎症抑制剂的筛选靶点具有较大价值，故本文对iNOS的调控机制及其抑制剂的研究进展作一综述。

1 NO的结构、分型及生物学特征

NO是一种可溶性气体，由L-精氨酸在一氧化氮合酶（NOS）催化下产生，NOS主要有3种类型，即主要存在于血管内皮细胞中的内皮型一氧化氮合酶（eNOS），存在于神经细胞的神经型一氧化氮合酶（nNOS）和病理状态下表达于多种细胞（如巨噬细胞、小神经胶质细胞、角质化细胞、肝细胞、星形细胞及血管内皮上皮细胞）的iNOS[1]。近年来，线粒体一氧化氮合酶（mtNOS）与炎症的作用也是研究热点[2]。哺乳动物的NOS为内源性生物合成酶，包含N末端的氧化酶区和C末端的还原酶结构。在生理条件下，受Ca2+浓度调控的eNOS和nNOS（合称为结构型一氧化氮合酶，cNOS）与钙调蛋白结合，通常低水平表达。其所合成的少量的NO对维持内环境稳定有重要作用，如调节血流与血压、保持微血管通透性、调节血小板的聚集和黏附、保持肠道黏膜的完整性、免疫调节、促进非胆碱能非肾上腺素能神经末端的神经递质释放以及作为神经末梢调节剂[3]等。并且，少量的NO可通过抗氧化作用而发挥抗炎功能。

持续过量的NO主要由iNOS合成，且iNOS自身结构决定其为钙离子和钙调蛋白非依赖性酶，在神经退行性疾病、自体免疫性疾病、肿瘤等疾病[4～7]中，iNOS表达均有显著增高。高浓度NO与聚集的O2-形成过氧亚硝酸盐，具有强烈的细胞毒作用。过氧亚硝酸盐类具有极强的氧化作用，通过胞膜迅速扩散，可以氧化多种生物分子，包括糖类、蛋白质、脂类，使DNA受损破裂，最终导致细胞死亡。iNOS与炎症密切相关，其主要受炎症因子及脂多糖刺激，产生过量NO自由基，并集中分布在与体内炎症相关的巨噬细胞、白细胞等细胞中。

2 iNOS的调节机制

细胞因子、细菌、病毒如肿瘤坏死因子（TNF）-α、干扰素（IFN）-γ、脂多糖（LPS），可诱导iNOS活化。有报道表明，iNOS表达最主要的调节在基因转录水平上。iNOS mRNA启动子包含核因子（NF）-κB、转录因子激活蛋白（AP-1）和信号转导及转录活化因子（STAT）-1α、干扰素调节因子（IRF）-1、cAMP反应成分结合蛋白（CREB）等识别位点，经LPS等刺激激活以下通路：丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路、NF-κB通路、蛋白激酶（PK）C通路、PKA通路、磷脂酰肌醇三羟基激酶/蛋白激酶B（PI3K-Akt）通路、c-Jun氨基末端激酶（JNK）-STAT通路[8～12]，信号通路级联放大后，iNOS基因转录水平提高，最终生成过量的NO。

2.1 iNOS与MAPK调节通路

MAPK是细胞内重要的信号传递者，参与了多种生理过程的调节。MAPK通路为丝氨酸和赖氨酸家族成员，其第八结构域的苏氨酶（Thr）-X-酪氨酸（Tyr）基序是主要活性位点，磷酸化后级联激活，MAPK的激酶（MAPKKK或MEKK）激活MAPK的激酶（MAPKK或MEK），后者磷酸化并活化MAPK，其4个亚族为细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）、p38 MAPK、JNK和大丝裂素活化蛋白激酶1（ERK5/BMK1）。激活iNOS有两种方式，Toll样受体及其配体相结合通过MAPK途径转导促进iNOS产生，或激活胞内激酶结构域及下游信号通路级联反应，活化转录因子，转录入核增加iNOS mRNA表达。

ERK1/2信号转导通路主要调控细胞的生长和分化，LPS+IFN-γ或 TNF-α +白 介 素（IL）-1 β联 合 刺激 p44ERK1和p42ERK2双重特异性磷酸化ERK，激活iNOS并在各种组织中广泛表达。JNK/应激活化蛋白激酶（SAPK）信号通路可被应激激酶、生长因子（EGF）、细胞因子（如TNF-α、IL-1）及某些G蛋白偶联的受体激活。JNK通过磷酸化转录因子（AP-1、NF-κ B、激活转录因子（ATF）-2/c-Jun）激活 IL-1α 、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-12等多种炎症细胞因子和iNOS mRNA。LPS与IFN-γ联合刺激MKK3/6磷酸化并激活p38MAPK，活化的p38MAPK易位入核。采用p38MAPK的特异抑制剂如吡啶咪唑类衍生物SB203580，可阻断p38MAPK介导iNOS基因表达的转录调控[13]。

BMK1/ERK5途径是MAPK家族的最新成员，可被生长因子、氧化应激或高渗刺激激活。BMK1/ERK5经上游激酶MEK5磷酸化激活后，诱导多种转录因子的表达。流体剪切应力是BMK1/ERK5的强刺激信号，BMK1/ERK5活化后，能够抑制血管内皮细胞凋亡，从而起到抗动脉粥样硬化的作用[14]。ERK5活化能增强骨骼肌核激素受体过氧化物酶体增生物激活受体（PPAR）-δ配体的抗炎作用，且增多血红素加氧酶（HO）-1/一氧化碳（CO）复合物[Ru（CO）3Cl2]2抑制NF-kB通路及iNOS基因表达[15]。

五味子酯A是从中华五味子（Schisandra sphenanthera Rehd.et Wils.）的果实中提取出的二苯环辛二烯结构的木聚糖，具有滋阴润肺、镇静安神的功效。Ci X等[16]经筛选确定五味子脂A的抗炎作用与其降低LPS刺激的巨噬细胞中TNF-α、IL-6和前列腺素（PG）E2的水平以及iNOS和环氧化酶（COX）-2的表达有关。其作用机制可能与降低MAPK中ERK、JNK、p38蛋白磷酸化有关，主要抑制ERK通路的磷酸化。

白鲜（Dictamnus dasycarpus Turcz.）根中的柠檬苦素类成分梣酮具有扩张血管、神经保护等作用。在LPS激活巨噬细胞的经典炎症模型上，梣酮的抗炎机制主要在于抑制ERK/MAPK通路中ERK的磷酸化水平，而与JNK、p38无关，并抑制IκB激酶活性，下调iNOS及COX-2的基因和蛋白表达[17]。

2.2 iNOS与NF-κB调节通路

NF-κB在转录及转录后水平调控iNOS，在哺乳动物中发现5个NF-κB/Rel家族成员，包括NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2（p52/p100）、RelA（p65）、RelB和c-Rel，形成同源二聚体或异源二聚体。细胞因子（如TNF、IL-1等）与其特异性跨膜受体结合，激活NF-κB诱导型激酶（NIK），NIK激活NF-κB抑制蛋白（IκB）激酶（IKK），IκB激酶包括MEKK 家族成员、N1K、MEKK1 和TPL-2。IκB为天然的NF-κB抑制蛋白，有p100、p105、IκBα、IκBβ、IκBε、IκBζ和Bcl-3，IκB解离后暴露DNA结合位点。NF-κB通路包括Toll-like受体途径、TNF受体途径、抗原受体途径、DNA受损反应途径、TPL（Tumor progression locus）2途径、染色质重构、非经典NF-κB途径[18]。

金合欢素（Jaceosidin）是由魁蒿（Artemisia princeps Pampanini cv.Sajabal，）甲醇提取物分离获得的黄酮类成分，在LPS刺激大鼠264.7细胞模型中可抑制氧自由基及NO产量和iNOS的表达（40µM，抑制率为90.7%），可能通过抑制NF-κB通路的分泌型碱性磷酸酶（SEAP）基因活性起到iNOS抑制的作用[19]。

多种植物多糖如当归多糖、云芝多糖、金钗石斛多糖等是通过激活NF-κB及MAPK而调控iNOS基因的表达，都有抑制iNOS生成的作用。CPE[20]是姜黄（Curcuma xanthorrhiza Roxb.）中的天然多糖提取物，呈剂量依赖性地降低LPS刺激后的NO、过氧化氢（H2O2）、PGE2、TNF-α含量，抑制NF-κB家族p50/p65蛋白的活性，保护LPS诱导的IκBα的降解，且无细胞毒性。

2.3 iNOS与cAMP-PKA调节通路

LPS和细胞因子刺激下，cAMP作为细胞内重要的第2信使诱导iNOS表达于平滑肌细胞、肾小球系膜细胞、心肌细胞、小鼠3T3成纤维细胞、大鼠腹膜巨噬细胞中。在大鼠264.7巨噬细胞中，cAMP类似物或cAMP合成激活剂Forskolin增强iNOS表达，为增强iNOS蛋白稳定而非转录活性[21]。

2.4 iNOS与PI3K-AKt调节通路

PI3K磷酸化3′-OH的肌醇磷脂肌醇环，产生PtdIns（3）P、PtdIns（3，4）P2、PtdIns（3，4，5）P3。典型的PI3K包括p110催化亚基和p85调节亚基（哺乳动物有3种亚型：α、β、γ）。PI-3K是胞内重要的信号调节分子，根据其底物和亚基结构特点分为3类，一类以其亚基机构又分为2种亚型。前者是与具有磷酸化酪氨酸残基的生长因子受体或连接蛋白相互作用引起构象改变，而后者通过Ras与p110直接结合与MAPK通路相连。PI3K抑制剂wortmannin处理的巨噬细胞，通过磷脂酰基醇特异性磷酸脂肪酶（PI-PLC）下游的信号和转录因子AP-1转录活性的增强，促进iNOS的表达，而非Akt通路或NF-κB通路[22]。

淫羊藿苷能抑制急性肝炎的细胞因子TNF-α、IL-6、NO及COX-2，且能下调肝组织中髓过氧化物酶（MPO）和减小LPS对巨噬细胞产生的细胞毒性。PI3K抑制剂的使用能削弱淫羊藿苷的保护作用，淫羊藿苷的体内、外试验表明其通过调节PI3K-Akt通路减轻炎症反应，下调iNOS基因表达[23]。

厚朴酚可抑制大鼠TPA引起的皮肤炎症和肿瘤转移，其来源于厚朴（Magnolia officinalis Rehd.Et Wils.）。Kuo DH等[24]研究厚朴酚的抗炎抗肿瘤作用，其主要是通过MAPK通路和NF-κB的上游PI3K-Akt通路，抑制iNOS以及COX-2表达。厚朴酚可以在20周之内显著降低肿瘤迁移率和发生率，并控制肿瘤大小。

2.5 iNOS与JAK/STAT调节通路

JAK/STAT为一重要细胞因子信号转导通路。细胞因子和受体的结合可以磷酸化JAK，活化的JAK使受体的酪氨酸残基磷酸化，产生含SH2结构域蛋白的“锚定位点”。含有SH2结构域的STAT分子可以与磷酸化的受体结合，并在JAK作用下磷酸化。磷酸化的STAT与受体的亲和力下降而脱离受体复合物，穿过细胞核膜进入核内，结合多种炎症相关基因包括iNOS基因的启动子上，增强基因的转录活性。JAK/STAT通路与NF-κB有交汇作用，STAT1主要由IFN激活，参与调节炎症和诱导炎症基因表达的作用，可通过701位酪氨酸位点与TNF-α受体1结合蛋白结合，抑制NF-κB活性。STAT3转录因子同时具有抑制炎症和促进炎症的作用，可诱导巨噬细胞产生抗炎因子IL-10，又与IL-6结合激活T细胞炎症通路[25]。与胰腺相关的蛋白1（PAP1）抑制NF-κB的激活过程是STAT3依赖性阻断STAT3信号通路即可阻止PAP1对NF-κB的抑制作用[26]。

江蓠（Gracilaria verrucosa Hudson）是一种常见的具有抗氧化和抗癌活性的海洋红藻。Lee HJ等[27]从其中提取了2种烯酮不饱和脂肪酸成分。该复合物可以有效抑制LPS激活巨噬细胞中的炎症递质NO、TNF-α、IL-6，其抗炎机制为通过抑制JAK/STAT通路中STAT1的磷酸化水平的蛋白表达和抑制NF-κB的核转录。

穿心莲的二萜内酯类成分脱水穿心莲内酯、穿心莲内酯及新穿心莲内酯均有抗炎、抗COX活性的作用，其中穿心莲内酯抗炎作用机制研究较为明确。穿心莲内酯在基因水平上抑制多种细胞因子及其受体，主要有肿瘤坏死超家族（TNFSF）14、TNF、TNFRSF6和IL1A，并可能通过影响多条通路而产生抗炎作用，其可下调JAK/STAT信号通路中JAK3和STAT5A，趋化因子CCL8和 CXCL11，TLRs家族的TLR4和TLR8，NF-κB通路中NFKB1的基因水平[28]。

2.6 iNOS与过氧化物酶体增生物受体（PPAR）调节通路

核激素受体过氧化物酶体增生物激活受体（PPARs）包括3种亚型，即 PPAR-α（NR1C1）、PPAR-γ（NR1C3）和 PPAR-β/δ（NUC1，NR1C2）。PPAR-γ研究最为广泛，其活化方式为识别特异性配体，促进PPAR-γ与视黄酸类受体（RXR）形成异二聚体，并与靶基因上游的应答元件结合，反式激活目的基因转录。PPAR-γ的活化可下调iNOS和NO[29]。研究表明，PPAR-γ激动剂可对抗转录因子AP-1、STAT和NF-κB活性，进而影响NF-κB信号通路的p65/RelA的二聚体活性。PPAR-β/δ的特异性配体抑制炎症因子在巨噬细胞和内皮细胞上的表达。PPAR-β/δ激动剂GW0742可衰减酵母多糖引起的多种炎症效应，如iNOS表达，氮化硝基化，TNF-α、IL-1及细胞凋亡因子的产生[30]。

三萜皂苷类积雪草苷在小鼠肺损伤模型中，通过上调PPAR-γ通路改善肺损伤情况，并减少炎症调节因子及信号分子。而PPAR-γ的抑制剂GW9662的使用，恶化了炎症状况，激活MAPK及NF-κB通路，上调肺组织中炎症递质iNOS、COX-2、TNF-α和IL-6的蛋白表达[31]。

2.7 iNOS与PKC通路

PKC为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族。目前在哺乳动物中发现的PKC至少包含12种不同结构不同生物活性的同工酶，每种同工酶的结构既高度保守又高度变异，分为典型PKC、新型PKC和非典型PKC三大类。受到外界刺激时，PKC受特异性底物蛋白吸引，自胞质向胞膜转移，通过多种膜蛋白的磷酸化作用使构象改变，N末端与C端解离，导致PKC激活。不同同工酶对iNOS信号通路的调节不同，血管平滑肌细胞在IL-1β刺激下通过PKC-δ途径激活ERK1/2使iNOS活化[32]。典型PKC依赖DAG使ERK磷酸化激活，PKCε、PKCζ分别通过诱导MKP1、PP2A对MAPK通路产生负调控[8]。PKC通路与其他调控通路关系密切。据文献报道，PKC激酶与PI3K/Akt通路交汇作用刺激MAPKK，激活IKK，释放NF-κB二聚体调控NF-κB信号途径，从而激活iNOS。6-姜酚是来源于生姜的β-羟基酮结构的单体成分，在LPS激活巨噬细胞炎症模型中，其降低iNOS、TNF-α的蛋白表达，可能通过阻断PKC和NF-κB通路，抑制Ca2+动员和影响线粒体膜电位而抗炎[33]。

2.8 iNOS与HO-1/CO通路

血红素加氧酶（HO）为控制CO、铁、血红素酶解的限速酶，3种亚型中HO-1主要与炎症和压力有关。NO诱导CO生成，CO反馈抑制NO产生。研究表明，p38、ERK、PI3K、NF-κB和PKC-delta都上调HO-1表达，HO-1/CO体系可能通过联合MAPK、PKC、NFκB通路调节iNOS表达，并产生抗炎作用[34]。

草木樨（Melilotus suaveolens Ledeb）乙酸乙酯提取物主要含香豆素类，可抑制致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6（P＜0.01）和增加抗炎因子IL-10，在蛋白和基因水平抑制COX-2，对NO的释放和iNOS mRNA表达呈浓度依赖的抑制作用（P＜0.01）。此外，草木樨的抗炎作用机制有增加HO-1mRNA水平及蛋白及抑制NF-κB活性[35]。

2.9 iNOS与通路的交汇作用

iNOS的转录同时受甲羟戊酸途径、神经酰胺、蛋白磷酸酶等调控，各通路之间相互作用，每个组分本身其调控者或效应者都是多个，构成了iNOS转录的复杂调控网络。而机体对于过量的NO也有自身的平衡调节及代偿保护机制，如PI3K-Akt通路、HO-1/CO通路等对NO信号通路的负反馈作用。NO对iNOS的负反馈是一条重要的调控通路。研究表明，NO可通过NF-κB通路自主调节iNOS表达，低浓度NO表达，NF-кB活化，上调iNOS表达，而在高浓度NO时，NF-кB和DNA结合活性被抑制，减少iNOS转录[36]。

水飞蓟素为乳蓟Silybum marianum L.中分离的活性黄酮成分[37]，具有抑制肺上皮癌作用，可改善细胞因子产生的肿瘤微环境中的慢性炎症和免疫抑制环境。在人类肺上皮细胞中，水飞蓟素（50～200 µmol·L-1）可抑制由细胞因子刺激上调的磷酸化STAT1（Tyr-701）和STAT3（Tyr-705）、磷酸化AP-1家族成员、磷酸化ERK1/2和JNK1/2、HIF-1α、p65和p50复合物。水飞蓟素通过调节STAT通路、MAPK通路、Akt通路以及NF-κB通路抑制iNOS产生。

3 iNOS与化学合成iNOS抑制剂

迄今为止，iNOS抑制剂包括非选择性抑制剂，如L-精氨酸竞争性抑制剂，现有氮G单甲基-左旋精氨酸（L-NMMA）、氨G-硝基-左旋精氨酸甲基乙酯（L-NAME）、氮W-硝基-左旋精氨酸（L-NNA）、氮W-甲基-左旋精氨酸（L-NMA）、氮G-硝基-左旋精氨酸（L-NAA）、氮G-硝基-左旋精氨酸（L-NA）和氮-亚氨基乙烷基-左旋鸟氨酸（L-NIO）。

此外，选择性NOS抑制剂能一定量地抑制iNOS的量，对eNOS不影响或影响较少，调节机制及靶点仍不明确，造成一定的毒副作用。N-[3-（氨甲基）苯甲基]乙脒（1 400 W）抑制iNOS的量为eNOS的200～5 000倍，为现今选择性和抑制性最强的抑制剂。1 400 W可抑制H357口腔鳞状上皮细胞癌株的侵袭，且免疫组化显示iNOS表达与头颈肿瘤的囊内扩散呈正相关，抑制剂有助于阻碍头颈肿瘤的发展[38]。胍类也是现在使用广泛的iNOS选择性抑制剂，抑制效力差且有较大的毒副作用，其可能通过抑制iNOS减少NO的含量、降低细胞内NO的浓度、减少P53突变和阻断细胞周期等途径[39]。氨基胍也是iNOS抑制的热点关注药物，权金星等[40]报道氨基胍对游离脂肪酸引起的人胰岛素β细胞凋亡有保护作用。

4 前景与展望

iNOS抑制剂虽然能在病理上表现出抑制，却无特异针对性，也阻碍了正常NO的释放，长期使用对人体不利。天然植物药与传统中药对于抑制iNOS的产生及炎症症状发挥了重要的作用。通过多条调控通路及其交汇作用，多靶点的中药有效成分抑制iNOS的活化及NO的产生，对机体的抗炎意义重大。

iNOS抑制剂的筛选可一方面以中医指导中药的功效主治来分类，在祛风湿、清热解毒、活血化瘀、祛痰止咳类的中药中筛选；另一方面以已经筛选出颇有活性的植物药成分为线索，找寻包含相似结构成分的中药资源。

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