大鼠肾被膜微环境对牙齿发育的诱导作用

白喜云，孙耀贵，李宏全

(山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801)

大鼠肾被膜微环境对牙齿发育的诱导作用

白喜云，孙耀贵，李宏全

(山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801)

目的 为探索一种组织工程化牙齿异位培养的理想环境，检测全牙胚、牙乳头及成釉器在肾被膜环境下的发育能力。方法 利用剖腹产取出胚龄18 d的大鼠胎儿，显微外科分离牙胚，并将之进一步分为牙乳头和成釉器两部分。使用特制玻璃移植管分别将获得的全牙胚、牙乳头及成釉器植入异体大鼠肾被膜下。2周后取出培养物，HE染色观察其发育情况。结果 在肾被膜微环境下，全牙胚在肾被膜下发育良好，形成较为完整的牙齿形态和结构，单独的牙乳头可以形成牙本质，而单独的成釉器无法形成特定形态的牙冠，也无法分化成釉质。结论证明肾被膜下是牙齿异位生长的适宜环境，ED18后成釉器发育仍然受到牙乳头调控，与此相反，牙乳头发育不再依赖成釉器的信号。

大鼠，肾被膜;微环境;牙齿;发育

1 材料与方法

1.1 材料

体视显微镜、普通光学显微镜(Olympus);显微外科镊(美国);普通外科手术器械(上海);长颈细口玻璃移植管(自制)。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及分组：妊娠18 d的SD大鼠以及10月龄SD大鼠，第四军医大学实验动物中心提供［SCXK2002-005］。大鼠根据受体接受的移植物不同分为三组：①全牙胚组;②牙乳头组;③成釉器组。每组5只供体和5只受体。

1.2.2 牙胚的收集与分离：取妊娠18 d的 SD大鼠，颈部脱臼处死，酒精浸泡全身。超净工作台内剖宫产术从子宫内收集胎儿。取胎儿头部，分离上下颌，在显微镜下用显微外科器械分离第一磨牙。进而将磨牙分为牙乳头和成釉器两部分，置DMEM培养液保存，备用移植。

1.2.3 肾被膜下移植术：选10月龄SD大鼠为受体，以戊巴比妥钠麻醉。垂直切开第一肋后方皮肤及腹壁，暴露肾脏。有齿镊轻轻夹起肾被膜一端，用外科刀打一小孔。将已吸取牙胚的长颈细口玻璃吸管口沿小孔深入肾被膜中部(即距入口1 cm处，见图1A)，同时推入牙胚，不需缝合。每个受体只移植一侧肾脏，植入两枚移植物。

1.2.4 移植体的观察：分别于移植后2周处死大鼠，肾被膜下收取移植物。4%多聚甲醛固定24 h，脱钙3 d。然后进行石蜡包埋，制作5 μm组织切片，HE染色观察移植体组织形态。

2 结果

所有受体在手术植入移植物后2周内饮食欲、行为均表现正常，移植物在肾被膜下均未发生丢失现象。移植物在肾被膜下发育的外观形态及组织发育情况如下。

2.1 全牙胚发育情况

见图1(彩插5)。ED18的大鼠全牙胚植入肾被膜下后整体生长良好，体积为3 mm×1.5 mm×1.2 mm大小，牙冠部形态基本与同期磨牙一致(见图1B，C)。牙体外感坚硬，色泽白而光亮。但牙根部平整，没有生长发育迹象。HE染色可见牙冠部形成典型的纵向排列的整齐釉柱结构，牙体部位牙本质小管柱状排列，结构良好(见图1D)。牙根部位平整，为成纤维细胞和上皮细胞包绕。

2.2 牙乳头发育情况

单独的牙乳头在肾被膜下发育良好，外观形态为不规则块状。HE染色可见移植物内牙本质小管柱状排列横断面影像，形成典型的牙髓牙本质复合体，移植物内有一定程度炎性细胞浸润(见图1E)。

2.3 成釉器发育情况

单独的成釉器在肾被膜下不能进一步发育，外观形态也呈不规则块状。HE染色可见移植物内结构混乱，无成釉细胞存活，也无规则釉柱或者单独的釉质结构形成，炎性细胞浸润明显(见图1F)。

3 讨论

早期牙齿的发育是上皮－间充质机制作用下一系列信号交互作用的结果，它决定了牙齿的形成部位、大小、形态和数量［2］。临床上要求研究者尽可能去模拟牙胚体内发育过程，实现牙齿局部组织修复甚至全牙再生。因此，建立科学、高效的牙齿培养系统十分重要。

牙胚异体异位培养作为牙齿培养的实验模型之一，是极富挑战性的工作。它不仅涉及新环境细胞信号对发育的调控，也涉及到异位营养供应及异体免疫排斥反应等问题。本实验将全牙胚在植入肾被膜下后，发育良好。色泽为乳白色，体积与正常牙齿大小相似，具有完整的牙冠结构。H＆E染色牙齿釉质、牙本质牙髓复合体结构与口腔正常生长的牙齿无显著差异。这说明肾被膜下可以为牙胚发育提供充足的养分，免疫排斥反应轻微，是进行牙胚培养的良好环境。但目前存在的问题是，牙胚位于牙床内生长时可以生成牙根，而在肾被膜下未能形成牙根。说明肾被膜下环境与牙床内环境差异依然较大，其细胞所释放的胞间信号不能支持牙乳头进一步向牙根分化，这是进一步实验需要解决的问题。

单独植入肾被膜下的成釉器不能独立发育。HE染色显示成釉细胞几乎完全死亡。没有釉基质沉积，钙化也不好。形成了骨样的成分，这可能是釉基质的分泌和釉质的形成过程中，牙乳头所发挥的功能不可替代。缺乏牙乳头的情况下，发育指示信息的反馈通路阻断，无法产生正常的基质，钙化过程也被中断。独立的成釉器组织在肾被膜下无法形成正常形态和功能的釉质，这显示了成釉器在牙齿发育中对于牙乳头组织的依赖性。在缺乏牙乳头的情况下，它无法独立完成发育过程。

与此相反，单独的牙乳头在肾被膜下则可以正常的发育。H＆E染色分析说明，单独的牙乳头形成形态学上较为理想的牙本质结构。也有一定密度的规则排列的成牙本质细胞与牙本质相连。牙本质结构矿化良好，外观形态除无牙冠结构以外，其他特征与肾被膜下培养的全牙胚无明显差异。显示牙乳头在肾被膜下可以独立发育。说明ED18的成釉器对牙乳头发育已经不在发挥作用，这与 Lesot等［3］的研究结果一致。

除肾被膜以外，研究显示大网膜、耳后皮下、眼窝内均可以进行牙胚的体内培养。但于金华等［4］对几种体内诱导环境进行比较后证实，从营养供应角度考虑，肾区血液供应丰富营养充足;从免疫学角度看，肾区为免疫特惠区，所产生的免疫排斥反应轻微，所以肾被膜是培养牙胚的最佳环境。这与本实验的研究结果一致。

总之，本实验初步证明肾被膜环境是牙胚异位发育较为理想的体内环境，可以作为组织工程牙齿再生实验的培养环境。进一步的研究应该考虑到胞间信号传导问题，以提高牙齿发育的可控度，降低炎性反应，逐步实现再生牙齿的梦想。

(本文图1见彩插5。)

［1］ Sumitaa Y，Honda M，Ohara T.Performance of collagen sponge as a 3-D scaffold for tooth-tissue engineering［J］.Biomaterials，2006，27：3238 －3248.

［2］ Pispa J，Thesleff I.Mechanisms of ectodermal organogenesis［J］.Dev Biol，2003，262：195 － 205.

［3］ Smith A，Lesot H.Induction and regulation of crown dentinogenesis：embryonic events as a template for dental tissue repair?［J］.Crit Rev Oral Biol Med，2001，12：425 －437.

［4］ 于金华，金岩，史俊南，等.大鼠牙胚同种异体异位移植的组织学观察［J］.临床口腔医学杂志，2005，21(5)：280－282.

Promoting effect of the sub-renal capsule microenvironment on the development of allotransplanted tooth in rats

BAI Xi-yun，SUN Yao-gui，LI Hong-quan
(College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu，Shanxi 030801，China)

Objective To explore a suitable culture environment for tissue-engineered teeth and to evaluate the developmental ability of full tooth germs，dental papilla and enamel organ in sub-renal capsule space.Methods Rat fetus at embryonic day 18(ED18)were obtained by Cesarean section.The full first molar germs were separated from fetus，and to separate them further into enamel organ and dental papilla by microsurgery.Subsequently，full tooth germ，enamel organ and dental papilla were transplanted into sub-renal capsule tissue of adult Sprague-Dawley rat by special glass tube and collected at 2 weeks after grafting.Paraffin sections were prepared and the histological changes of transplants were examined with H＆E staining.Results Full tooth germs were well developed into normal shape and structure in the rat sub-renal capsule microenvironment.The dentin-pulp complexes were formed by separated dental papillas.However，the separated enamel organs were not well developed，both tooth crown and enamel were not formed in this group.Conclusions The results of this study indicate that renal subcapsular space is a suitable culture environment for allotransplantated teeth development.After ED18，enamel organ development is still regulated by signals from dental papilla，but in contrast，dental papilla development is no longer dependent on the signals from enamel organ.

Rat;Sub-capsular space，kidney;Microenvironment;Tooth;Development;Rat

Q95-33，R78.12

A

1005-4847(2011)01-0042-03

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.01.010

牙齿是动物体内最坚硬的器官，在咀嚼食物、防卫攻击及维持颌面部正常形态等方面具有重要功能。然而，哺乳动物的牙齿终身只有一次替换机会，成年后牙齿釉质不再含有活细胞，一旦被致病因素破坏就会造成永久性的不可修复的损伤。因此，临床上对牙齿缺损修复和功能性牙齿再生技术的需求十分迫切。近年来基于牙齿发育和干细胞理论的牙齿再生技术成为人们研究的热点，其当前面临的难题之一是器官培养模式。迄今为止已经在鸡胚尿膜绒毛膜、小鼠眼窝、耳后皮下及肾被膜下等部位进行过牙胚异体异位培养实验并获得成功［1］。为进一步验证肾被膜下牙胚发育能力，2006年～2007年我们先后对牙胚肾被膜下移植技术作了改进，在全牙胚移植的基础上，牙乳头与成釉器的单独发育能力进行了检测。

山西省青年科技研究基金(2012021029－1);山西农业大学青年科技研究基金提供资助(2008006)。

白喜云(1976 － )，男，讲师，硕士，从事胚胎早期发育研究。E-mail： xiyunbai@126.com，Tel：0354-6286659。

李宏全，教授，博士生导师，研究方向为兽医外科学。E-mail：hongquanlijoe@yahoo.com.cn

2010-02-24