新城疫病毒核衣壳蛋白的结构和功能

丁 铲

(中国农业科学院上海兽医研究所，200241)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是副黏病毒科副黏病毒亚科禽腮腺炎病毒属的成员之一，也是家禽的主要病原之一。NDV病毒粒子自然状态下呈多形性，大小150 nm～400 nm；病毒粒子内有长1000 nm螺旋状的核衣壳结构，直径为17 nm～18 nm；囊膜上覆盖有直径8 nm～12 nm的糖蛋白纤突。NDV基因组为单股负链RNA，分子量 5.2×106～5.7×106道尔顿。NDV基因组包括6个基因(3'-NP-P-M-F-HN-L-5')编码至少8种蛋白(6种结构蛋白，和由P蛋白基因经RNA编辑，从移码了的阅读框翻译出2种非结构蛋白V和W蛋白)。目前已知的基因组长度分别有3类，ClassⅡⅠ-Ⅳ型 NDV为15186 nt，ClassⅡ基因型V-IX型为15192 nt，而 ClassⅠ为15198 nt[1]。基因组RNA两端还有顺反子外片段：3'端引导(Leader)序列及5'端尾随(Trailer)序列，这些区域是病毒复制所必需的。在各基因的前后端有保守的转录调控片段，分别为基因起始端和基因末端。NDV的基因组非常高效，约95%用来编码病毒结构蛋白。基因和基因间有1个～47个核苷酸不等的基因间片段。螺旋状的核衣壳是RNA复制的模板，核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，NP)与基因组RNA共同组成了核心结构，磷蛋白(Phospho protein，P)和大蛋白(Large protien，L)附着在核心结构上，共同组成了RNP或转录复制复合物作为最小感染单位。NDV囊膜上有两种表面糖蛋白：血凝素-神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidase，HN)蛋白和融合(Fusion protien，F)蛋白，前者参与宿主细胞的吸附，后者通过与细胞膜的融合侵入宿主细胞。F和HN蛋白也是NDV引发免疫反应的主要保护性抗原蛋白。病毒囊膜内侧为基质(Matrix protien，M)蛋白，能抑制宿主细胞基因的转录和翻译，破坏宿主细胞的骨架结构，参与病毒的组装和释放。通过RNA编辑途径翻译的两种非结构蛋白V和W，前者主要抑制宿主细胞干扰素的产生，有利于病毒复制；后者的功能目前还不是很清楚。

在感染过程中，NDV吸附蛋白HN首先与敏感细胞表面的唾液酸受体结合，这种结合作用可以引起吸附蛋白HN和融合蛋白F构象发生变化，后者的融合肽被释放出来，使病毒的囊膜与细胞膜发生融合，释放核衣壳化的基因组RNA和RNA聚合酶到胞质中；然后在胞质中进行mRNA的转录和翻译、基因组的复制和病毒的组装[2]。

就负链RNA病毒而言，能否形成RNPs结构是NDV复制增殖的关键所在，其具有功能活性的最小单位为RNP复合结构[3]。该结构由病毒的基因组RNA与核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)共同组成[4]。以该类病毒的裸基因组RNA直接转染时，RNA在细胞内不能进行有效的转录和复制[5]。在NDV的复制过程，首先进行的是各种基因的转录。病毒RNA聚合酶以核衣壳化的(-)ssRNA(RNPs)为模板，先与基因组(-)ssRNA的3'端Leader序列中的单一进入位点结合，转录出一个短的Leader RNA；然后利用病毒基因组各基因两端存在的各种转录起始及终止信号转录出各种病毒mRNA[6-7]。P和L蛋白均作为转录复合体的亚基组成，并在转录延伸、加poly(A)尾(大约5个～7个A)等方面发挥功能。该转录过程是在线性的基因组上，通过转录复合体的移动，并与位于基因组上的NP蛋白相互作用，按每一个基因的起始及终止位置不断转录产生出各个基因的单一顺反子，这些病毒mRNA再利用宿主细胞的翻译系统翻译出各种结构和非结构蛋白。

在各基因转录的发生后，病毒RNA聚合酶也利用基因组3'末端序列存在的复制信号启动反义基因组(+)ssRNA的复制，(+)ssRNA再与NP、P和L蛋白结合形成RNPs结构，病毒RNA聚合酶以新合成的RNPs结构为模板启动正义基因组(-)ssRNA的复制，然后(-)ssRNA与各种翻译出的病毒蛋白装配生成子代病毒粒子[10-11]。病毒蛋白的转录是从病毒基因组3'端第56个核苷酸开始的，而病毒基因组的复制则是从第1个核苷酸开始的[8]。

1 NP蛋白的结构与功能

ClassⅡ基因型Ⅰ-Ⅳ型和ClassⅠ基因型NDV的NP基因全长为1747 nt，ClassⅡ基因型Ⅴ-Ⅸ型NDV的NP基因全长为1753 nt，即在NP基因的非编码区多出了6 nt，研究表明该6个碱基的出现与病毒的毒力没有明显关系，至于它的确切功能目前尚在研究之中。NP基因的1400位～1700位碱基的GC含量较高，有的甚至达到70%左右，而与Ⅰ-Ⅳ的毒株相比，Ⅴ-Ⅸ型NDV毒株所多出的6个碱基恰好位于该区域，至于6碱基的插入是否与该区域特殊的结构有关，还是与其它的一些致病机制有关，目前还没有定论。

所有NDV NP蛋白基因编码区长度均为1467 nt，编码489个氨基酸残基，NP蛋白mRNA的3'非编码区在强弱毒株间表现出相当大的差异，但能否作为强弱毒判定的标准目前尚无定论。许多副粘病毒的NP蛋白在起始的多个氨基酸相当保守，这可能与病毒基因组RNA的结合有关[12]，而末端的125个氨基酸只有很低的同源性，推测该末端的氨基酸可能与病毒的RNA共同形成复制与转录的模板[13]。同多数副粘病毒一样，NP蛋白合成后具有自动组装的特性[14-15]，形成鲱鱼骨状的结构，研究表明N端1位～375位氨基酸与该结构的形成有关，而375位～439位氨基酸则决定了该结构的长度[16]。这种自动装配功能可以被P蛋白抑制，P蛋白通过其氨基端与NP蛋白的羧基端结合，阻止NP蛋白的自动装配，防止NP蛋白的“非法”衣壳化。从439位氨基酸到489位氨基酸的C端，是与RNA的结合区，蛋白带有-7到-12个的净电荷，是非保守的(约占20%)，这个区域是一个高变区和主要负电区。NDV NP蛋白的氨基末端的最远端区域并不参与核壳的组装，因此可能是NP的中间的碱性结构域与RNA相互作用[9]。

NP蛋白是NDV 6个结构蛋白之一。NP蛋白的形态学特征呈鲱鱼骨样结构[17]，呈易弯曲的螺旋状结构，病毒基因组RNA被大约含有2500个～2600个NP蛋白亚单位缠绕。每个NP蛋白，直径约18 nm，长约1 um，分子量为56 ku。NP是NDV核衣壳的主要的蛋白质部分，它和病毒基因组RNA结合，形成螺旋对称的卷曲状核衣壳。该NP结构相当紧密，通过高盐或氯化铯梯度分析发现NP蛋白是唯一一种不能从核衣壳中去除的病毒多肽，这表明NP蛋白对于核衣壳组成至关重要，并与病毒基因组RNA紧密联系，与病毒的增殖密切相关[18]。

NP蛋白上分布有3个活性区：(1)P蛋白结合区，NP蛋白通过该区活性，与P-L蛋白结合成为依赖RNA的RNA聚合酶亚基；(2)NP-NP相互结合位点，从而使病毒的RNP形成螺旋状弯曲；(3)与病毒基因组的结合位点，NP蛋白通过非共价键形式，以准确包裹6个核苷酸的方式包裹基因组和基因组复制的中间体——正链RNA。

NDV基因组的3'端和5'端均有一段RNA序列作为衣壳化信号，NP蛋白对RNA的衣壳化依赖于RNA上的衣壳化信号，NP与含引导序列的RNA的结合能力比不含引导序列的RNA高达5倍～10倍。P蛋白通过和NP蛋白的相互作用，抑制NP蛋白对不含引导序列的RNA的结合，防止RNA非法衣壳化。

NP蛋白仅在细胞质中生成并聚集，并不像流感病毒的NP那样，在细胞质中合成后还会进入细胞核，经修饰后再回到细胞质中。NP蛋白除具有衣壳化功能外，不具有任何酶的活性。NP蛋白还能通过与M蛋白的相互作用，在组装病毒粒子时，准确地将病毒RNP包装入病毒粒子中。由于M蛋白是碱性蛋白，拥有大量的碱性氨基酸，带有大量的电荷，而NP蛋白则也带有大量的电荷，因此双方能通过电荷相互作用，从而使病毒的核酸物质包装入病毒中。

与病毒表面的囊膜糖蛋白相比，NP与其它3个内部蛋白受免疫选择压力的影响要小[8]。NP蛋白也具有免疫显性抗原决定簇，但目前的研究表明NP蛋白不具有免疫保护功能[19]。NP蛋白含有3个抗原区分别为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ。其中Ⅰ和Ⅲ两个抗原区相互重叠。NDV NP蛋白的抗原性同样在逐渐发生变化，因此NDV蛋白的变化并不仅仅局限于囊膜糖蛋白，而是所有蛋白均在发生进化的。选择压力并不是蛋白抗原发生的主要原因，由于受选择压影响小的内部蛋白与囊膜糖蛋白相比，在进化过程中它们对应的基因变异的程度是同步的。从进化学角度看，毕竟，RNA病毒本身缺乏有效的转录和翻译校对系统致使其抗原性易变，是其赖以生存的主要方式之一。

2 NP蛋白与病毒的基因组转录和复制

NDV的基因组为负链RNA，这意味着当它们在感染进入宿主细胞时，其基因组不能直接作为mRNA进行病毒相关蛋白的翻译，首先需要以其负链RNA基因为模板的转录，以形成正链mRNA。NDV基因组遵循6碱基原则，所有NDV基因组长度均为6的倍数[20]，只有当NDV基因组RNA核苷酸的数量为6的倍数时，病毒的RNA才能有效进行复制转录，这种现象被称为“6碱基原则”[21]。从基因组3'端到5'端，每6个碱基能被一个NP蛋白亚单位能准确地包裹，并以此方式依次对全部基因组RNA进行包裹。如果RNA链全长正好是6的倍数，壳体包裹持续到3'端时，则基因组RNA全部碱基恰好被NP蛋白亚单位全部覆盖和包裹；如果基因组不符合6的倍数，则基因组不能被NP蛋白群包裹，以致所形成RNP没有活性。因此，NP蛋白对病毒基因组RNA及反基因组RNA(病毒复制所必须的正链中间体RNA)的壳体包裹对病毒的复制非常重要[22]。从理论上讲，每个ClassⅠNDV带有2533个NP蛋白，而ClassⅡ基因型Ⅰ-Ⅳ型和ClassⅡ基因型Ⅴ-Ⅸ型NDV分别带有2531和2532个NP蛋白。不管是病毒的基因组RNA复制的中间体正链RNA，还是复制的子代病毒基因组(负链)，NP蛋白均能迅速对其包裹，主要是防止细胞中的核酸酶对其降解。没有NP蛋白包裹，这些RNA就没有生物学活性，就不能转录或复制。

作为转录复合体的亚基组成元件，P-L蛋白与位于病毒基因组中的NP蛋白相互作用，通过转录复合体的移动，在线性的基因组上，按每一个基因的起始及终止位置不断转录产生出各个基因的单一顺子。从病毒基因组3'端到5'端的转录病毒基因过程中，在转录NP下游基因时，转录酶总是重新回到最初的NP转录起始点，再往下游方向作线性滑动转录，而每次转录则增加一个下游基因，如此往复运动。据此，笔者将其描述为“拉链模型”(Zip Modle)。

NDV的这种转录方式被称为转录极性效应[23]，越靠近3'端的基因其转录产物越多，越靠近5'端转录产物的量越少，也就是说病毒基因转录和翻译的水平是NP>P>M>F>HN>L。L蛋白的基因虽然占病毒全基因组总长度的一半，但它的转录和翻译水平最低。可以想象，位于最下游的L蛋白由于是酶类，而作为生物化学催化剂，病毒的复制周期活动中所需要的量一定较少。

根据病毒复制的要求，NP蛋白与P蛋白一起，可能会作为病毒的立即早期蛋白被首先转录翻译，因为这两种病毒蛋白与病毒的基因转录、mRNA的转移、病毒基因的复制密切相关，而其他结构蛋白(如F蛋白等)，或对mRNA转录有抑制作用的M蛋白，主要在感染晚期方能大量转录表达[24]。

在病毒的感染过程中首先需要进行的是转录产生mRNA，翻译出最初必需的蛋白，之后才开始产生正链复制中间体RNA。NDV的NP基因RNA干扰试验表明，可导致病毒产量和其他病毒结构蛋白mRNA转录水平的下降，表明了NP蛋白对于其他病毒组分转录翻译乃至病毒复制的重要性。

当NP蛋白合成未达到一定数量时，以病毒基因组RNA为模板合成的正链RNA主要为转录产物mRNA；当翻译的NP蛋白的量积累到足够浓度时，它即可与基因组中的先导RNA序列编码区内的顺式作用元件结合，停止转录过程，启动复制过程。因此，只有到转录翻译进行到一定的时候，以能够保证有效数量的NP蛋白组份用于复制时，子代病毒的RNA才能得以大量合成。从结构上分析，mRNA的形成和复制中间体正链RNA的形成都是在相同的依赖RNA的RNA聚合酶的作用下完成的，但前者在特定部位表现出一定的差异，如帽子结构m7GpppAm和poly(A)尾的形成；而后者则没有这类与翻译有关的结构，这就导致子代病毒RNA的复制必须有待于转录翻译过程进行到一定的程度，即感染细胞内有足量的相关病毒蛋白(如NP蛋白等)才能进行[25]。

3 病毒蛋白对宿主细胞转录和翻译的抑制作用

在NDV感染的早期，我们在体外常常观察到一种现象：无论是何种宿主细胞，在病毒感染后，往往立即停止其生长，这就是所谓的“宿主细胞蛋白质合成关闭现象”。这种现象意味着：1.蛋白质合成关闭是细胞本身抵抗病毒入侵的一种自身防卫反应，以停止蛋白质合成的方式来限制病毒的增殖，并和干扰素产生、细胞凋亡等非特异性抗病毒机制一起，形成细胞进化中所产生的天然保护应答；2.这种细胞蛋白合成的关闭也可能是病毒感染细胞过程中所产生的特定生物学效应，其目的是终止细胞自身蛋白质的合成，使其相应的系统转而为病毒增殖服务。

在感染的最早期，L蛋白可能将宿主细胞mRNA上5'端帽子结构(10 nt～15 nt)切下来，作为病毒RNA基因转录的引物[34]，而宿主细胞的帽子结构又有一种优先翻译特点存在[35-36]。与大部分单股负链病毒相似，NDV基因组存在着从3'到5'转录效率由高到低的极性现象。推测，NP蛋白以及P蛋白可能被优先转录，而NP和P蛋白的mRNA的5'端非翻译区又可能存在着优先选择性翻译结构，所以这两种蛋白作为病毒转录复制的所必需的最初的立即早期蛋白而被大量翻译[26]。

这个现象可能就是所谓的病毒mRNA的选择性翻译现象。从逻辑上可以理解，在病毒感染宿主细胞后，病毒mRNA和细胞mRNA之间势必在利用有限的翻译资源的过程中存在竞争，病毒mRNA必须具备较大的优势才能取代细胞mRNA，以完全独享这一资源[28]。事实上，在感染初期，病毒mRNA在相对数量上并不占有优势，这就需要一种机制来优先翻译病毒蛋白，并抑制翻译细胞蛋白。这种机制可能是：对细胞而言，表现为细胞蛋白合成抑制、细胞mRNA的帽子结构被病毒的L蛋白裁剪并被转加到病毒mRNA上，细胞mRNA在核内被降解、细胞mRNA从核内向胞浆转运过程的抑制、细胞内PKR酶系统的活性抑制等[27]。以流感病毒为例，这些现象在主要包括病毒蛋白NS1的抑制[29](在NDV可能是M蛋白行使了这一功能[30])和细胞P58IPK蛋白的抑制[31]；细胞mRNA翻译起始和延伸阶段的抑制；eIF4E的去磷酸化[32]，这些机制全面地抑制了细胞的翻译过程。而对于病毒来说，表现有病毒mRNA帽子结构依赖的选择性翻译；病毒mRNA的天然优先翻译；病毒基因中的前导RNA序列，即Leader和Trailer序列能对宿主细胞转录的产生抑制，但必须得在M蛋白的参与下才能发挥作用；病毒mRNA 5'-UTR介导的优先翻译；细胞激酶MNK1被抑制，不能使帽子结构起始因子eIF4G磷酸化，进而影响到其与mRNA的结合，造成细胞蛋白合成受阻；eIF4G被用于病毒mRNA；病毒蛋白合成的临时调节机制等。大量的研究资料表明，病毒成分还对宿主细胞RNA分子的加工及转运过程具有抑制作用，如NP蛋白可以结合到宿主细胞的mRNA 3'端poly(A)结构上，使得mRNA滞留在细胞核内，不能转运到细胞质中以进行下一步翻译。总之，通过多种途径，宿主细胞的转录和翻译被抑制，从而保证了病毒翻译效率的最大化[33]。

结束语

病毒感染是一类连锁事件，这类连锁事件中存在着密切联系，表明了病毒在感染过程中一种全面调控的系统特点，病毒的结构蛋白的功能呈多样化，特别是在感染早期出现的病毒内部结构蛋白。研究表明，作为立即早期蛋白，NP蛋白在病毒感染和复制的早期具有非常重要的功能，它与形成RNPs的其它两个蛋白的以及与RNA的结合对于其功能发挥至关重要。我们认为，NP蛋白可以作为病毒治疗的药物靶标，针对NP蛋白的这些结合位点，进行相应的药物设计应该是有相当的前景的。筛选出来的药物小分子药效实验表明，能严重抑制病毒在细胞上的增殖。虽然目前对NP蛋白的研究相对清楚，但还需要对它的其它功能进行深入解析，特别是与M蛋白的相互作用还有待于进一步研究。

NP蛋白作为NDV中6个结构蛋白之一，竟有如此多而精妙的功能，这种系统性周密之于病毒如此简单的生命组成，不能不使我们感叹生命的精巧和进化的力量。

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