盐酸克伦特罗残留检测方法研究进展

李庆华 陈 肖 彭道和 肖幼荣

（1.湖北省鄂州市动物卫生监督所，鄂州 436000；2.湖北省鄂州市杜山畜牧兽医站，鄂州 436000；3.湖北省鄂州市城区动物检疫站，鄂州 436000）

盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLB），俗称“瘦肉精”，别名克喘素、氨哮素、氨必妥、氨双氯醇胺、氨双氯喘通，是一种平喘药，属于β-兴奋剂。该药分子式为C12H18Cl2N2O-HCl，分子量为313.7，为白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，熔点161℃，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。CAS号：37148-27-9。

20世纪70年代末，美国等发达国家开始将CLB用作“营养重分配剂”及“促生长剂”的实用性开发研究；20世纪80年代被广泛应用到畜禽生产中。研究显示克伦特罗能增强脂解和减慢蛋白质分解代谢，可明显提高饲料转化率和瘦肉率；但如果使用剂量过大，则会对动物和人产生严重的毒害作用。1986年开始，欧美等发达国家已严禁畜牧生产中应用CLB。中国农业部也在1997年3月以[农牧发（1997）3号文]严令禁止β-肾上腺素能激动剂在动物生产中的应用。尽管如此，目前国内外非法使用CLB的情况仍非常严重，食用含CLB残留的肉品中毒事件屡有发生。造成CLB屡禁不止的原因一方面是经济利益驱使；另一方面是目前国内外检测CLB的方法、手段还不够完善，缺乏建立宰前监测体系和快速、简单和精确的检测方法。下面就目前国内外检测CLB的主要方法及进展情况作一简单介绍。

1 高效液相色谱法（HPLC）

HPLC适合测定热不稳定和强极性的β-激动剂及其代谢产物，而且，HPLC可以与柱前提取、纯化及柱后荧光衍生化反应和质谱（MS）等系统联用，容易实现分析过程的自动化。Liu B.等人于2011年建立了CLB在猪组织中的HPLC-UV检测方法。猪组织经固相萃取后，进一步经超声辅助分散液液微萃取纯化，采用HPLC-UV进行检测，该方法的检测限为0.07 μg/kg，样品添加回收率在87.9%～103.6%之间。聂建荣等人建立了以高效液相色谱-质谱（HPLC-MS/MS）快速检测动物尿液中的莱克多巴胺和克伦特罗分析方法。样品经SCX柱净化浓缩后，以乙腈-5mmol/L乙酸铵（65∶35，V/V）为流动相，采用Kromasil CN色谱柱分离，通过电喷雾（ESI）离子源电离多反应监测（MRM）对莱克多巴胺和克伦特罗作定性和定量分析。在1.0～500.0 μg/L的范围内线性良好（r＞0.999）。在0.5、4.0、40.0、80.0、200.0 μg/L添加水平下，回收率为89.7%～103.3%，相对标准偏差为2.0%～7.8%。检测限（S/N=5）为0.1 μg/L。

因HPLC具有检测灵敏度高，且检出假阳性率低等优点，目前我国已将HPLC法作为检测CLB残留的半确证性方法，该方法的最低检测限范围为1～15 ng/g。其缺点是样品前处理时间长，且处理过程比较繁琐，需要购买高效液相色谱仪等贵重仪器，操作人员需经专业培训，因此在实际应用中受到一定的限制，主要在一些大的研究机构和实验室应用。

2 气相色谱-质谱法（GC-MS）

GC-MS法是把色谱高效快速的分离效果和质谱高灵敏度的定性分析有机结合起来，能在多种残留物同时存在的情况下对某种特定的残留物进行定性、定量分析，而且具有更高的检测极限。Russo，M. V. 等人于1997年建立了牛尿中CLB残留的GC-MS检测方法。样品经固相萃取，C18净化后经GC-MS检测，该方法的检测限为0.1 ng/mL。吴银良等人建立了同时测定动物肝组织中盐酸克伦特罗和盐酸莱克多巴胺残留量的GC-MS分析方法。动物肝组织样品在碱化的条件下用乙酸乙酯和异丙醇混合溶剂提取，经SCX固相萃取（SPE）柱净化，洗脱液经氮气吹干后经双三甲基硅基三氟乙酰氨（BSTFA）衍生后进行检测。盐酸克伦特罗和盐酸莱克多巴胺的检出限分别为0.30和1.00 μg/kg。

GC-MS与HPLC相比，检测灵敏度总体来说更高，检出假阳性率更低。因此，我国将GC-MS法定为检测CLB的确证性方法（NY/T468-2001）。其缺点与HPLC相似，适用于大的研究结构和实验室，不能进行现场检测。

3 毛细管区带电泳法（CE）

Anurukvorakun，O.等人于2010年建立了猪肉中同时检测克伦特罗、莱克多巴胺和叔丁喘宁的多残留CE方法，该方法对所有分析物的检测限均为0.3 ng/g。段建平等人建立了同时测定饲料中西马特罗、盐酸克伦特罗与沙丁胺醇的毛细管区带电泳紫外检测方法。考察了实验参数对分离和检测结果的影响。在最佳实验条件下，在60mmol/L的柠檬酸柠檬酸钠运行缓冲液（pH6.29）中，上述3种物质在8min内完全分离。西马特罗、盐酸克伦特罗和沙丁胺醇的线性响应范围为0.1～1.0mg/L，最低检测限（以信噪比为3计）分别为0.02，0.03和0.02 mg/L。

CE法非常适用于那些难以用传统的液相色谱法分离的离子化样品的分离和分析，其分离效率可达几百万理论塔板数。与HPLC和GC-MS相比，CE具有操作简单，色谱柱不受样品污染，分析速度快，分离效率高，样品用量少，运行成本低等优点，有利于实际样品的分析。但是毛细管电泳迁移重现性、进样准确性以及检测灵敏度方面相对来说不及HPLC和GC-MS，且缺乏合适的、配套的检测器，在残留分析的应用中受到一定的限制。

4 免疫分析技术（IA）

目前，国内外用于检测盐酸克伦特罗的免疫分析技术主要有放射免疫分析技术、酶联免疫分析技术、滴金免疫技术及时间分辨荧光免疫分析技术等。其中，应用最广泛的为酶联免疫分析技术（ELISA）。ELISA的优点是特异性强、灵敏度高、操作简单、检测迅速，特别适用于大批量样品的检测。Ren，X.等人于2009年建立了猪肉和鸡肉中CLB残留的ELISA检测方法。该方法对2种样品的检测限为0.1 ng/mL，平均回收率在81%～102%之间。李平等人用直接竞争ELISA对动物组织中CLB残留量进行快速筛选检测。方法将CLB与蛋白质载体偶联制备了CLB-BSA和HRP-CLB结合物，以CLB-BSA免疫实验兔获得特异性抗体，并成功建立了CLB残留直接竞争ELISA检测方法及检测试剂盒。检测线性范围为0.1～62.5 ng/mL，检测低限为0.10 ng/mL，尿、肝、肉和饲料的加标回收率为60.3%～115.0%。目前，我国进出口检验检疫、兽医卫生部门及屠宰场多采用德国R-Biopharm和英国Randox等公司生产的CLB-ELISA检测试剂盒。但由于进口试剂盒价格昂贵，在一定程度上限制了它的使用范围。国内在应用ELISA检测CLB方面的研究起步较晚，早期研发的ELISA试剂盒普遍存在灵敏度不够、假阳性率高、不稳定等诸多问题，难以推广应用。但随着技术的发展及科研人员的不断努力，目前国内研发的盐酸克伦特罗ELISA试剂盒也开始大量投入到商品化生产和实际应用中，经与同类进口试剂盒进行对比研究，结果显示国产试剂盒在灵敏度、准确性、稳定性和回收率均接近进口试剂盒水平，且价格上占有很大的优势。

胶体金免疫层析技术是90年代在免疫渗滤法基础上建立的一种快速简单的方法。其关键技术是抗CLB单克隆抗体的制备、胶体金的制备、金标单抗的制备。Zhang G.等人于2006年建立了猪尿中CLB残留的胶体金检测方法，其检测线可达1.0 ng/mL，整个检测过程在10 min以内完成。姜艳彬等人通过研究制成了可检测出猪尿样中盐酸克伦特罗浓度为2 ng/mL的试纸条，结果可在8 min之内进行判断。综上所述，试纸条具有操作简单、快速、检测时间短，基本不需要任何仪器，对操作人员无专业要求等优点，特别适用于现场大批量样品的快速筛选。

5 生物传感技术

生物传感技术是当今世界上倍受关注的一门综合性很强的技术领域，是“迈向21世纪的医学检验技术”之一。该技术是将生物活性物质作为敏感元件（生物识别系统），再配上适当的换能器及输出显示装置所构成的分析工具，从而成倍的突破了微量检测的“极限”，大大加快检测过程，使得全自动无试剂检测成为可能。国外已有生物传感器技术检测CL残留的报道。Pizzariello A.等人应用分子印记聚合膜（MIP）作为分子识别系统检测牛肝中CLB残留。此方法特异性强，缺点是反应时间长，灵敏度不高。目前，检测CLB的生物传感技术中，最有发展前景的是酶免疫传感技术。它是酶标免疫技术与光电分析技术相结合而产生的一种电化学免疫分析技术。目前酶免疫传感器的灵敏度可达0.01μg/kg。而且可在几分钟之内完成检测全过程。

生物传感器具有选择性好、响应速度快、样品用量少、操作简易、价格低廉、定量准确，且其结构简单、体积小、携带和使用方便、可以实现连续的在线检测和反复使用等优点。

综上所述，现有盐酸克伦特罗残留检测方法中，HPLC，GC-MS，CE等仪器方法检测灵敏度高，检出假阳性率低，但样品前处理过程繁琐，需要购买昂贵的仪器设备，操作人员须经专业培训，不能实现现场检测；ELISA作为一种最常用的免疫分析法，具有灵敏度较高，特异性较强，成本低，仪器设备简单等特点，但检出假阳性率较高，只能作为常规筛选方法。胶体金免疫层析方法和生物传感技术灵敏、快速、简单，可以克服上述方法的缺点，并从定性和定量2个方面实现CLB残留的现场监测，是今后研发检测CLB残留的重要方向。

随着我国经济的快速发展，食品安全越来越受到人们的关注。CLB在食品中的残留可严重危害人民群众的身体健康，虽然全国各地每年都开展严厉打击非法生产、经营、使用CLB等药品的违法犯罪行为，但收效并不理想。消费者熟悉的双汇集团旗下公司被央视3.15节目曝光的健美猪真相就是鲜活的例子。因此，研发CLB简单、快速、灵敏的检测方法是大势所趋，也迫在眉睫。希望能从根本上铲除“瘦肉精”等违禁药品的使用，切实保障畜禽产品的质量安全，使人民群众吃上真正的放心肉。