自身免疫抗体标志物在乳腺癌早期诊断中的意义①

葛 昆 张敬国 臧爱民 (河北大学附属医院中心实验室,保定071000)

1 引言

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。据世界卫生组织报道,全球每年有超过120万人被诊断患有乳腺癌,其五年生存率与肿瘤分期密切相关。Ⅰ期或更早的乳腺癌病人五年生存率可大于95%,而当乳腺癌发展到Ⅲ期或更晚期时,病人的五年生存率还不到50%,早期诊断是治疗乳腺癌、降低死亡率的关键。目前临床上检测早期乳腺癌的方法主要有钼靶X线摄影、超声、磁共振扫描(MRI)等影像学手段。在我国,受核磁检查费用所限,以MRI来开展原发癌的早期筛查尚不现实;超声虽然经济简便,但存在着较高的漏诊率;钼靶X线影像主要适用于对40岁以上女性的检测,尽管如此,原位癌的检出率还不到50%,而且小肿块也不易被发现[1,2]。

肿瘤标志物一直被认为是最具潜力的肿瘤早期检测手段之一,是肿瘤发生发展的分子基础,对肿瘤的免疫诊断、药物治疗、免疫生物治疗能起到重要的靶向作用。目前临床上使用的乳腺癌标志物多为血清中的肿瘤相关蛋白,主要有CA125、CA153、CEA、CA199和CA27-29,普遍存在阳性率偏低,敏感度和特异度难以兼顾的问题,对进展期乳腺癌和转移癌还有一定的诊断价值,但对早期诊断意义十分有限。自身免疫抗体是目前最受关注的一类肿瘤标志物候选分子。应用自身免疫抗体作为早期肿瘤的监测指标,能比现有的临床手段提前几个月甚至几年发现癌症[1,3]。另外,自身免疫抗体在肿瘤的病情监测、临床分期、预后分析及药物靶点研究等方面都具有重要的应用价值。本文就自身免疫抗体在乳腺癌早期检测中的应用价值作一综述。

2 肿瘤相关抗原与自身免疫抗体的产生

肿瘤相关自身免疫抗体是机体针对特异性肿瘤相关抗原产生的免疫应答产物,血清表达水平高且持续时间长。这些抗原主要是细胞癌变过程中出现的新抗原及过量表达的抗原,通常经糖基化、磷酸化、氧化、蛋白酶切割等翻译前修饰过程,会形成新的抗原表位或增加自体抗原表位,从而被免疫系统识别为外来物质,与主要组织相容性复合体或辅助性T细胞结合引发免疫反应,产生自身免疫抗体。不过大多数肿瘤自身免疫抗体是针对过量表达的抗原产生的,如p53的免疫源性来自于过表达、点突变及其在肿瘤细胞胞内和核内的积累。过量表达的蛋白能增加抗原负载,引发癌症病人机体产生抗体[4]。

由于肿瘤相关抗原一般来源于胞内,而胞内蛋白是如何激发体液免疫反应的,目前还不是很清楚。一种假设是异常肿瘤细胞死亡后,修饰过的胞内蛋白被释放到胞外,从而引发体液免疫反应[5];另一种假设是异常死亡的肿瘤细胞所释放的肿瘤相关抗原与白细胞和未成熟的树突状细胞G-蛋白受体相偶联,导致白细胞和未成熟的树突状细胞迁移[6]。这一组织特异性肿瘤相关抗原的趋化活性可能会给免疫系统提供组织损伤的危险信号,而且肿瘤相关抗原与未成熟的树突状细胞相互作用也能产生免疫源性,从而激发免疫系统产生抗体促进组织修复。

还有一种假设与特异免疫源性修饰有关,肿瘤相关抗原与外来抗原结构相似,因而可引发体液免疫。肿瘤相关抗原与热休克蛋白(heat shock proteins)结合可形成有免疫调节特性的热休克蛋白[7,8]。胞内蛋白定位到肿瘤细胞表面将会被免疫系统识别为异己,继而激发免疫反应。血液中发现的肿瘤相关多肽有些来源于胞内,也可被认为是潜在的抗原。如肝癌病人血清中发现的钙网蛋白片段和内源性循环系统的蛋白等[9,10]。最近Villanueva等[10]研究指出由肿瘤细胞分泌的胞外蛋白酶,以协同或补充降解途径的方式切割蛋白产生肿瘤相关多肽,而由此方式产生的多肽其免疫源性也更加多样化。

针对肿瘤相关抗原产生的免疫应答可以发生在肿瘤形成的早期阶段,因此可以在其它肿瘤标志物和细胞表型发生变化之前从癌症病人血清中检测到高滴度的自身免疫抗体,使之成为癌症早期检测的分子信号[2]。这些肿瘤相关抗原在癌变过程中激发免疫应答效应,从而可以作为临床免疫治疗的潜在靶标。

3 自身免疫抗体对乳腺癌的诊断价值

根据免疫监视理论,肿瘤的产生源于基因突变,从而导致肿瘤相关抗原的过量表达,大多数肿瘤相关抗原都会引起人体免疫系统的识别,继而引起一系列的免疫反应[11]。所有这些免疫应答都始于肿瘤形成初期,检测到血液中这些肿瘤相关抗原的特异性抗体,也就实现了对肿瘤早期诊断的目的。

p53、HER2/neu、MUC1和 NY-ESO-1 的自身免疫抗体是最先应用在乳腺癌诊断中的抗体类标志物。这些有免疫活性的肿瘤相关抗原有助于识别自身免疫抗体构象,是乳腺细胞癌变的关键因子。近年来有研究发现HSP60的过量表达与肿瘤侵袭和转移密切相关,HSP60的自身免疫抗体对非浸润性乳腺癌和浸润性导管癌均有较高的诊断价值[12,13]。尽管如此,单一一种自身免疫抗体对早期乳腺癌的诊断特异性还有一定局限性。如HER2/neu自身免疫抗体虽然能在早期乳腺癌病人血清中检测到,但并不是乳腺癌所特有的,其它癌症中也普遍存在[2,5]。多种自身免疫抗体联合使用是提高诊断敏感性和特异性的趋势。

大部分肿瘤标志物单独使用时敏感性和特异性偏低,不能满足临床检测的需要。鉴于肿瘤细胞具有杂合性,一种类型的癌症可产生多种抗原引起的免疫应答,因此联合多种抗体诊断提高特异性是临床应用的一种必然趋势[14]。Lu等[15]分析了乳腺癌病人 p53、HER2/neu、IGFBP-2和 TOPO2a的免疫活性,经受试者工作曲线(ROC)分析,单独使用p53并不是检测乳腺癌的显著指标(AUC=0.48,P=0.538),p53和HER2/neu联合AUC能提高到0.61(P=0.006),进一步将四种标志物联合AUC达到0.63(P=0.001)。很多研究也报道了相似的结果,说明联合多种标志物能实现较高的癌症诊断敏感性和特异性。

值得注意的是,多种标志物联合检测乳腺癌也要根据临床需要合理选用,过多指标的联合应用不一定能提高临床诊断价值,在肿瘤的诊断、随访检测中应该有所区分、分别对待。Chapman等[16]用7种抗原表达谱(p53、c-myc、HER2/neu、NY-ESO-1、BRCA1、BRCA2和MUC1)检测了94例正常人血清,97例原发性乳腺癌病人血清和40例导管原位癌病人血清,统计分析显示BRCA1没有诊断价值,其它6种标志物对原发性乳腺癌的诊断敏感性在8%～34%之间,对导管原位癌的诊断敏感性在3%～23%之间,对这两种乳腺癌的诊断特异性都在91%～98%。联合6种标志物可将原发性乳腺癌的诊断敏感性提高到64%,导管原位癌的诊断敏感性提高到45%,特异性为85%,这与钼靶X线影像对早期乳腺癌的检测敏感性相当。

选择合适的能引发自身抗体的肿瘤抗原是一项艰巨的工作。目前Cancer Immunome Database数据库中列出了2316个克隆的2743条序列,而且这一数字还在不断增长。然而大多数抗原不适合用于诊断,因为他们的滴度太低,仅在某一类型的癌症病人体内存在,而且正常人和良性病变患者也能检测到。通过筛查pubmed数据库中所有有关自身免疫抗体可能作为癌症诊断指标的研究,所有这些抗体至少要做5项调查才能纳入最后的分析。就此有人提出了抗体诊断价值分析的3个质量标准,只有具备其中两项才能作为候选肿瘤标志物:(1)必须有高滴度的血清学反应(以1:1000计算);(2)要在至少40%的恶性肿瘤病人中检测到;(3)正常人外周血中不存在。目前只有三种抗体符合这一标准,MUC-1、p53和SOX。因此开发新的肿瘤抗体标志物是目前工作的重点[14]。

4 自身免疫抗体筛选方法

已开发的乳腺癌自身免疫抗体种类较多,差异也大,这与病人遗传背景、肿瘤大小及其检测方法有关。事实上,自体抗原在良性疾病、炎症和自身免疫疾病病人体内都会存在,因此如何区分炎症或其它非癌病变引发的自身免疫抗体和癌症引发的自身免疫抗体成为关键问题。蛋白质组学为同时开发多种乳腺癌自身免疫抗体提供了有力手段。

4.1 SEREX SEREX技术以其操作简便易行、一次实验即可进行疾病相关抗原cDNA的测序和分析、得到的肿瘤相关抗原可信度高等优点而广泛应用在肿瘤标志物的筛选中。但其筛选效率比较低,在大规模开发肿瘤特异性自身抗原方面受到限制。应用SEREX 发现了 annexin XI-A、p80、S6、RPA32 和NYESO-1等多种自体抗原[2,17-19]。其中NY-ESO-1被证明是免疫原性最强的肿瘤抗原之一,可同时激发患者体内的体液免疫和细胞免疫,已被应用于一些肿瘤的临床免疫治疗研究中。本研究小组在SEREX技术的基础上,增加了文库淘洗过程,发现了3种新的乳腺癌自身免疫抗体构象[20]。

4.2 SERPA SERPA是另一种将蛋白质组技术和血清学相结合的新方法,将2-DE分离的蛋白质转膜后分别与患者和健康人血清杂交,通过比较两组间的反应性来查找目的蛋白,进而运用质谱技术进行鉴定。RNA结合蛋白调节亚基(RS),原癌基因DJ-1,葡萄糖6磷酸脱氢酶,热休克蛋白70蛋白1(HS71),二氢脱氢酶等都是用此方法发现的乳腺癌肿瘤相关抗原。

4.3 蛋白微列阵 蛋白微列阵是自身免疫抗体构象筛选的有利工具。它由固定于不同种类支持介质上的蛋白微阵列组成,阵列中固定分子的位置及组成是已知的,用未经标记或标记(荧光物质、酶或化学发光物质等标记)的生物分子与芯片上的探针进行反应,然后通过特定的扫描装置进行检测,结果由计算机分析处理。国内外众多研究表明,蛋白质芯片技术在检测敏感性和诊断特异性方面均明显高于传统肿瘤标志物的检测方法。Li等[21]应用蛋白质芯片技术分析103例不同分级的乳腺癌患者血清标本,筛选出的3个蛋白(4.3 kD、8.1 kD、8.9 kD)对0-Ⅰ期乳腺癌有较好的鉴别作用。

5 展望

乳腺癌病人体内发现的自身免疫抗体所对应的蛋白,在乳腺癌发生发展过程中具有重要作用,抗体与抗原都是肿瘤发生的分子基础。与雷帕霉素敏感相关的mTOR(Mammalian target of rapamycin)磷酸化途径蛋白如核糖体蛋白S6、真核细胞延伸因子2、真核细胞延伸因子2激酶、HSP90都是在乳腺癌病人体内发现的肿瘤相关抗原。乳腺癌病人体内的自身免疫抗体也会直接与DNA修复相关组分Ku蛋白、拓扑异构酶1、复制蛋白A 32kD亚基等发生作用,影响细胞复制与增殖。

自身免疫抗体在癌症早期检测方面具有如下优点:(1)可以用来检测无症状人群,甚至可以比现有的手段提前5年检测到疾病[6]。(2)针对肿瘤相关抗原产生的自身免疫抗体直接进入外周血,检测样本易于获取。(3)相对于抗原来说,抗体比较稳定,不易水解,能相对较长时间的存在于血清中。(4)抗体的浓度要高于相应的肿瘤相关抗原,一个抗原分子激发免疫系统产生的自身免疫抗体要扩增很多倍,所以自身免疫抗体比肿瘤相关抗原更容易检测。(5)半衰期长(7天),因此样品采集没有严格的时间限制,样品收集更容易。(6)目前已有多种试剂和技术可用来检测自身免疫抗体。

同时自身免疫抗体的存在,也为开展免疫治疗提供了新的靶点。HER2/neu抗体广泛用在HER2阳性乳腺癌病人的免疫治疗中,作为新辅助化疗的一种药物,HER2/neu抗体对HER2/neu表达阳性的肿瘤病人有很好的治疗作用,提高了无复发生存期[22]。由于免疫治疗的靶标不存在于正常人体内,对病人治疗产生的副作用会相应较小。目前根据体液和细胞免疫已开展了针对肿瘤相关抗原的各种抗肿瘤疫苗策略。随着更多的肿瘤相关抗原及其自身免疫抗体的开发,乳腺癌的早期诊断和免疫治疗将跨向一个新的台阶。

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