低氧影响干细胞成骨分化的研究进展*

刘晓奇， 闫景龙

(哈尔滨医科大学附属第一医院骨四科，黑龙江哈尔滨150001)

氧稳态是机体或细胞正常功能所必需的，低氧是人正常发育的一个重要的生理因素，并参与许多疾病的发生、发展。在骨发育过程中，组织和细胞缺氧是经常存在的。体内生长板软骨增殖区氧浓度仅为2% －5%，肥大区氧浓度为 0.15% －1%[1]。机体损伤后，由于损伤部位血流中断或血肿形成，造成局部氧分压降低。在骨折血流中断处，中央部位氧分压甚至降低到0% －2%[2，3]。骨折修复需要机体在骨折部位重建血运，以便吸收损伤组织和转运营养物质。在机体代谢过程中，组织细胞内氧稳态的维持由多种生理因素调控，其中低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor－1，HIF－1)是目前发现的最重要的调控因子，在调控局部和系统低氧反应中起着关键作用[4]。骨折之初，血管损伤，血供减少甚至中断，导致骨折局部呈低氧状态，处于骨折局部低氧环境中的细胞将有可能通过低氧 /HIF－1反应通路而发生功能调整性变化，从而参与调节或影响骨折愈合的进程[5]。

全身或局部的血供减少导致的氧含量下降，均会引起骨代谢的改变，导致骨量丢失。现就近年来关于低氧对细胞分化及功能的影响做一下介绍。

1 低氧对细胞分化功能的影响

将间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)短暂暴露在低氧中对MSCs的生存并没有产生明显影响[7]。降低氧张力严重损害了人MSCs的脂肪化和成骨化分化能力。提升氧浓度从1%到3%则可恢复其成骨分化能力。同时，低氧能够提升软骨细胞分化和软骨基质合成;这种低氧诱导现象可能在软骨细胞分化和软骨内成骨过程中起到加强和保护软骨表型和功能的作用[6]。蒋能刚等[7]研究指出在正常血清培养条件下，MSCs对低氧有较好的耐受性，48 h后低氧可显著促进干细胞增殖。金小岚等[8]认为低氧可以明显抑制骨髓基质细胞向脂肪细胞分化而促进其向成骨细胞分化。Salim等[9]也发现低氧对MSCs成骨性分化几乎没有影响，相反，体外实验短时间低氧抑制了成骨细胞和间质前体细胞骨小结形成和细胞外钙沉淀。Gruber等[10]指出骨细胞在低氧条件下培养72 h，代谢活动逐渐减少;低氧抑制细胞有丝分裂反应与成骨性分化标志物碱性磷酸酶和骨钙素的表达。当骨细胞再次在正常氧含量下培养7 d后，它们的反应性恢复正常。这些发现表明低氧条件下成骨细胞可以短暂生存，但生长分化能力降低。氧含量恢复后，它们增殖分化能力恢复正常，这也暗示复氧或血管形成是骨折愈合的关键一步。

2 低氧对干细胞成骨分化时相关细胞因子表达的影响

低氧可通过调节干细胞某些细胞因子的表达，影响细胞的功能。有研究认为低氧降低了人成骨样细胞Runx2/Cbfa1的表达－低氧96 h后，Runx2、I型胶原和碱性磷酸酶mRNA的表达都减少，并呈时间依赖性，碱性磷酸激酶的活性也以同样的方式减少[11]。同时低氧也下调BMP－2和Runx－2表达，阻碍多潜能间质前体细胞和成骨细胞成骨性分化[9]。2007 年 Potier等[12]也证实将 MSCs短暂暴露在低氧中导致:(1)Cbfa1/Runx2、骨钙素和Ⅰ型胶原持续下调(直到暴露后的14 d);(2)持久上调骨桥蛋白mRNA的表达(直至暴露后的28 d)。Nagano等[13]移植高醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)的MSCs使骨产生早期的修复和骨质替代，高ALDH的MSCs对低氧有更高的反应性，上调Flt－1、CXCR－4和 angiopoietin－2的表达。Christopher等[14]也发现低氧压抑CXCL－12的表达是细胞因子诱导成骨细胞移动的关键一步。低氧可使循环骨髓衍生成骨前体细胞通过CXCR4/SDF－1途径募集到骨修复部位[15]。骨样细胞比成骨样细胞表达产生更高的ORP－150，低氧培养提升矿化基质的合成，碱性磷酸酶活性在早期低氧培养时增加，但在成骨时减少;低氧张力提升了成骨细胞分化和继之的骨细胞形成[16]。并且低氧诱导最初的成骨细胞表达IGF －II而非 IGF －I[17]。Gross等[18]指出体内急性失用和体外直接低氧可导致成骨细胞快速上调OPN表达。在OPN可促进破骨细胞迁移和黏附的背景下，低氧诱导的成骨细胞OPN表达可能调整失用诱导的骨吸收。低氧刺激可通过成骨细胞HIF－1α、ILK/Akt和mTOR途径加强BMP－2 mRNA和蛋白水平[19]。

3 低氧预处理对干细胞活性的影响

干细胞成骨分化时的活性同样受到氧张力的影响。Volkmer等[20]指出骨前体细胞如hMSCs定居在低氧环境中，而且，在体外3D培养条件下氧含量也较低。甚至移植入体内后在血管还没形成前也处于低氧状态。他们首次指出在成骨诱导前低氧预处理hMSCs，保存了其在低氧条件下成骨性分化的潜能。低氧预处理增加人MSCs的能动性和改进了治疗潜力。MSCs在低氧下培养增加了迁移率，并诱导表达cMet－肝细胞生长因子的主要受体(体内迁移和肝细胞生长因子的反应性被认为是MSCs募集和活性的关键调节因素)。在鼠缺血部位注射低氧预处理的MSCs后，血流的恢复明显提前。他们的研究表明在植入前低氧预处理MSCs可以改进组织再生潜能[21]。Kubo等[22]发现移植低氧预处理的细胞导致缺血组织血管化程度增加，并加强了干细胞治疗的形态和功能上的益处。低氧预处理显著增加了各种抗氧化和生存基因的表达。相比在氧含量正常条件下培养，低氧预处理的细胞可产生较低的氧应激分子聚集且能使更多的细胞生存，经28 d治疗后，缺血肢体的血管密度和血流恢复明显较好。Tang等[23]最近的研究指出CXC趋化因子SDF－1和CXC趋化因子受体4(CXCR4)的相互作用精密调节缺血导致低氧诱导的骨髓来源循环干细胞或前体细胞的募集。Oh等[24]报道低氧预处理可作为干细胞植入损伤组织抵抗缺血环境的新策略;这种策略改善了植入细胞和宿主细胞在损伤部位的生存力，他们认为低氧预处理脂肪组织来源的间质干细胞增加了细胞的生存能力和标志基因表达。低氧可以提升人MSCs的增殖，加强集落形成能力，并阻止成骨细胞分化[25]。Ceradini等[26]证实内皮细胞表达 SDF －1 指示组织缺血的存在，这种表达可以被低氧诱导因子1直接调节。有意思的是，骨髓环境中同时存在低氧和SDF－1，说明低氧可能是自体干细胞运输和功能的必要条件。

综上所述，干细胞对目标组织微环境的耐受是其应用过程中值得考虑的重要因素，体内的氧张力明显低于体外的细胞培养环境。软骨的整个代谢过程也是在一个低氧的环境下进行;因此，在细胞治疗中，MSCs必需克服低氧环境。研究表明，在MSCs治疗中大部分干细胞不能适应长期的低氧环境而发生凋亡，从而影响治疗效果。因而，研究低氧对细胞产生的影响，了解低氧条件下细胞增殖、分化的规律就显得尤为重要。

尽管现在已经对低氧影响干细胞的功能有了较多的认识。但仍有许多问题尚待解释。如低氧条件下骨形成的调控机制?细胞因子在低氧条件下的表达及参与机制?长期低氧对干细胞增殖和分化有怎样的影响?这些都需要我们进一步研究。

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