羟基红花黄色素A的提纯新工艺研究

(郑州大学化工与能源学院，河南郑州 450001)

红花(Carthamus tinctorius L.)属于双子叶植物纲的菊科一年生草本植物［1］。具有活血通经、祛痛止痛的功效［2］，是中医传统的活血化瘀药。红花化学成分复杂，生物活性广泛，目前是当今世界研究和应用的“热点”植物之一。红花黄色素为红花抗血栓的有效部位［3］，HSYA是红花的主要药效成分［4］，具有抗血小板激活因子的作用［5］，已作为治疗心脑血管疾病的新药被列入国家药品标准［1］。

大孔吸附树脂分离技术是20世纪60年代末发展起来的一种新型分离技术［6］。大孔吸附树脂是一类新型有机高分子聚合剂，具有稳定性高、选择性好、不受无机物的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、易于连续操作、成本低等诸多优点。目前，大孔吸附树脂已广泛应用于环保、化工、医药和食品等领域。张亮等［7］研究了大孔吸附树脂对红花提取液的纯化，制得的HSYA纯度为35.7%。

中草药原料中许多有效成分受热易发生氧化、水解、聚合结构变形等化学结构的变化，从而影响药效。膜分离技术是一种新型、高效的分离技术，以压力差或电位差为推动力，利用筛分原理达到对不同分子量组分的分离、浓缩和提纯［8］。将膜分离技术用于红花提取液的分离纯化过程，其相对温和的操作条件更利于保持产品的性能稳定［9］并且节能。

目前报道的关于纯化HSYA的方法很多，但是HSYA的纯度不够高，难以达到注射剂用药的要求，本文在前期研究的基础上，旨在探讨新的工艺路线，为制备高纯度、高附加值的HSYA产品奠定基础。

1 实验部分

1.1 材料和装置

红花，购于河南农科院，产地新乡;羟基红花黄色素A对照品，HPLC 99%，四川省维克奇生物科技有限公司;甲醇，色谱纯99.9%;磷酸，分析纯85%;无水乙醇，分析纯99.7%;乙醇，医用酒精95%;PES10超滤膜，上海亚东核级树脂有限公司;大孔吸附树脂，沧州宝恩化工;FILMTEC纳滤膜。

电子分析天平，BS224S，北京赛多丽仪器系统有限公司;紫外/可见分光光度计，UV－2450，日本岛津公司;高效液相色谱仪，Agilent 1100，美国Agilent公司。

1.2 实验方法

通过静态吸附、脱附实验选取适宜的大孔吸附树脂;通过膜性能的测定选取适宜的纳滤膜。在前期研究的基础上，制备HSYA提取液，经过微滤除去固体颗粒物质，微滤透过液作为本研究的原料液。精制原料液的工艺流程如图1所示。

图1 HSYA精制工艺流程图

通过超滤过程除去大分子物质，通过大孔吸附树脂吸附、洗脱剂洗脱，收集醇洗脱液，最后经纳滤浓缩得浓缩液(浸膏状)。水溶解浸膏物，采用HPLC检测溶液中HSYA的纯度。

1.3 分析方法

1.3.1 HSYA 的提取率

HSYA提取率的计算公式为:

式中:c为n次提取液混合后溶液中HSYA的浓度，g/L;V为n次提取液混合后溶液的总体积，mL;m0为所用红花的质量，mg。

1.3.2 HSYA的标准曲线的制定

利用紫外可见分光光度计，在波长401 nm处，测定不同浓度HSYA的吸光度，绘制HSYA对照品的吸光度—浓度的标准曲线。精确称取HSYA对照品13.8 mg，蒸馏水定容于50 mL容量瓶中，得到浓度为 0.276 g/L 的 HSYA 溶液。精确移取0.7、0.8、1.0、1.1、1.3、1.5、1.7、1.9 mL 于 25 mL 容量瓶中，蒸馏水定容。以各溶液在401 nm处的吸光度值A为纵坐标，溶液的浓度c为横坐标做图，得标准曲线为 A=0.03851c+0.00688(r=0.99994)，线性范围:7.728 ～20.976 mg/L。其中，c的单位为 g/L。

1.3.3 HPLC 色谱条件

色谱柱:ZORBAX SB－C18 5 μm 4.6 × 250 mm;流动相甲醇:0.5%磷酸水溶液(体积比40∶60);流速:0.8 mL/min;柱温:20℃;检测波长:401 nm。以保留时间定性，峰面积定量，外标法计算。

1.3.4 大孔吸附树脂吸附量、解吸率的测定

吸附量Q的计算公式如下:

式中:Q为吸附量，mg HSYA/g树脂;c0为吸附前溶液的浓度，g/L;ct为吸附后溶液的浓度，g/L;V为溶液体积，mL;W为树脂质量，g。

解吸率的计算公式如下:

式中:c为滤液中HSYA的浓度，g/L;V为滤液体积，mL;Q为树脂的吸附量，mg HSYA/g树脂;W1为吸附饱和的树脂质量，g。

1.3.5 膜分离性能的测定

截留率R的计算公式如下:

式中:c1和c2分别为原料液和透过液中HSYA的浓度，g/L。

渗透通量的计算公式如下:

式中:V为透过液体积，L;S为膜的有效面积，m2;t为取样时间，h;J为渗透通量，L/(m2·h)。

2 实验结果与讨论

2.1 HSYA 的提取

通过正交实验确定了最优的提取HSYA的工艺条件为:水提取，提取温度45℃，提取时间45 min，料液比为1∶20，提取2次。在最佳条件下提取HSYA的平均提取率为7.516 5%。提取时各因素对提取率的影响大小依次是:提取时间＞提取次数＞提取温度＞料液比。

2.2 大孔吸附树脂的选取

除了大孔吸附树脂的分子结构外，宏观结构对其吸附量、吸附速度以及吸附选择性等性能也有一定的影响。树脂的宏观结构主要包括颗粒的形状、粒径、粒径分布、孔隙率、孔的形状、孔的大小、孔径分布以及比表面积等。9种大孔吸附树脂的物理参数如表1所示。

表1 选用树脂的物理参数

吸附量是衡量大孔吸附树脂分离天然产物的重要技术参数之一，不同树脂对不同成分的吸附量不同，这是基于树脂对物质具有选择吸附的能力。本实验选择了9种大孔树脂对HSYA的吸附量和解吸率进行了探讨，结果如图2、图3所示。

由图2可知，对HSYA吸附量较好的树脂有HPD200A、HPD300、HPD100、HPD700 和 HPD722。大孔吸附树脂的比表面积影响树脂的吸附量，比表面积越大，吸附量也越大，同时树脂的孔径也影响吸附量，孔径太大或者太小吸附量都会降低，HPD200A的比表面积和孔径比较适中，吸附量最大;HPD100A的比表面积小，孔径大，导致吸附量最小。

图2 9种树脂对HYSA的吸附量

图3 9种树脂的解吸率

由图3可知，树脂 HPD100的解吸率最高，HPD700的解吸率最低，但树脂的解吸率都普通较高。树脂的吸附强度和洗脱剂的强度影响树脂的解吸率，在同一洗脱剂下，主要是树脂的吸附强度影响解吸率，只要树脂对目标成分的吸附没有达到死吸附，解吸率都不会太低。

2.3 纳滤膜的选取

植物有效成分提取分离常用的蒸发分离主要基于不同组分挥发性的差异，很可能对热敏性物质造成不可逆转的损害，并且耗能。而膜分离主要基于分子的大小(分子半径与其相对分子质量相关)，纳滤膜的截留相对分子质量介于超滤膜和反渗透膜之间，对相对分子质量在200～1 000之间的低分子有机物以及多价盐有较好的截留效果。除了考虑对HSYA的截留外，同时还应考虑膜的渗透通量，这是选择用膜的两个关键参数。实验用膜的性能参数见表2。

表2 膜性能参数表

3种纳滤膜的分离性能结果如表3所示。采用切割相对分子质量为1 000的NF270－400膜作为分离膜，其渗透通量最大，但对HSYA的截留率相对而言偏低;切割相对分子质量为300的NF90－400膜的截留率最高，但渗透通量最小;切割相对分子质量为600的NF200－400膜的截留率与NF90－400膜的截留率相当，但其渗透通量要大于NF90－400膜的渗透通量。由此可知，纳滤膜的切割相对分子质量越小，其对HSYA的截留率越高，同时其渗透通量也越小。

表3 3种类型的膜对分离性能的影响

2.4 纳滤膜的截留率R的变化

实验过程中3条工艺路线中NF200－400纳滤的截留率如表4所示。

表4 3条工艺路线中纳滤膜NF200－400的截留率

由表4可知，浓度影响膜的截留率，浓度越小，截留率也越大;乙醇的存在影响膜的截留率，可以使膜的截留率增大，由于HSYA易溶于水，不容易无水乙醇，乙醇的存在可以使部分HSYA沉淀，乙醇的浓度越大，截留率也随之增大。

2.5 HSYA提纯工艺路线的评价

超滤过程是利用一种压力活性膜，在外界推动力(压力)作用下截留料液中的胶体、颗粒和相对分子质量相对较高的物质，而相对分子质量小的物质透过膜的分离过程。通过超滤过程，可除去大部分的胶体，大分子的物质以及大量的有机物。由于HSYA易溶于水，不溶于无水乙醇，溶解度随着乙醇浓度的增加而减小，乙醇的存在使HSYA部分沉淀。因此，先经超滤过程除去大分子物质，再经过大孔吸附树脂的吸附、洗脱过程富集HSYA，最后经过纳滤浓缩得到较高纯度的HSYA产品。通过高效液相色谱法检测产品中HSYA的纯度，溶液Ⅰ中HSYA占58.250%，溶液Ⅱ中 HSYA 占50.700%，溶液Ⅲ中HSYA占54.072%。通过超滤过程除去溶液中的大分子物质，由工艺路线一制得的产品纯度较高，即58.250%。

3 结论

通过不同工艺流程的试验，发现采用PES10超滤膜、大孔吸附树脂HPD200A与NF200－400纳滤膜相结合的方法纯化HSYA，产品纯度最高可达到58.25%。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中国药典［M］.北京:人民卫生出版社，2005.

［2］宋立人，洪 峋.现代中药学大词典［M］.人民卫生出版社，2001:924－928.

［3］Wu W，Li J R，Chen W M，et al.Inhibition effect of flavones from C.tinctorius L.against P M N aggregation and adhesion induced by platelet activating factor［J］.Chin Pharm J(中国药学杂志)，2002，37(10):743－745.

［4］Meselhy M R，Kadota S，Momose Y.Two new quinochalcone yellow pigments from carthamus tinctorius and Ca2+antagonistic activity of tinctormine［J］.Chem Pharm Bull，1993，41(10):1796－1798.

［5］Zang B X，Jin M，Si N，et al.The antagonisitic effect of hydroxyl safflor yellow A against platelet activating factor［J］.Acta Pharm Sin(药学学报)，2002，37(9):696－699.

［6］汪红武，刘艳清.大孔吸附树脂的应用研究进展［J］.中药材，2005，28(4):353－355.

［7］张 亮，林鹏程，李虎业.大孔吸附树脂纯化羟基红花黄色素 A 的研究［J］.安徽农业科学，2010，38(12):8984－8985.

［8］王晓琳，张澄洪，赵 杰.纳滤膜的分离机理及其在食品和医药行业中的应用［J］.膜科学与技术，2000，20(1):29－36.

［9］刘海霞，龚彦文，赵俊廷.纳滤膜浓缩混合油过程中的操作条件研究［J］.粮油加工，2009，(1):47－50.