大肠杆菌琥珀酸和乙酸合成途径的删除及其重组菌株的D-乳酸发酵

周丽，田康明，左志锐，陈献忠，石贵阳，Suren Singh，王正祥

1 江南大学生物工程学院 生物资源与生物能源研究中心 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122

2 Department of Biotechnology and Food Technology, Durban University of Technology, Durban, South Africa

乳酸是世界上公认的三大有机酸之一，乳酸及其衍生物在酿造、食品、农业、医药、化工、皮革、烟草、印染、纺织等行业中用途广泛。乳酸异构体之一——D-乳酸是一种重要的手性中间体，同时也是合成生物可降解聚乳酸塑料的原料之一，其添加量对聚乳酸产品的机械强度、热稳定性等影响很大。随着人们环保意识的提升，聚乳酸高分子材料研究活跃，乳酸成为一个极具潜力的化学品，并有望成为继柠檬酸之后的又一大宗发酵产品。然而，外消旋型及低光学纯度、低化学纯度的乳酸在很多领域的应用受到限制，人们期望获得以高产量、高底物转化率、高生产强度生产高化学纯度和光学纯度D-乳酸的方法。

大肠杆菌Escherichia coli可发酵产生高光学纯度的D-乳酸，且生长速度快、营养需求简单。与乳酸细菌相比，重组大肠杆菌作为乳酸生产菌株的优越之处在于其转化率常常可超过 90%[1]。作为基因操作工具菌，E. coli遗传背景清楚，易于进行基因操作，尤其是近年来大肠杆菌基因敲除技术的快速发展[2]，使得应用代谢工程策略在大肠杆菌中积累乳酸更易行。现有研究表明，具有pta和ppc基因突变的菌株JP203在有氧条件下生长到10 g/L干重菌体 (DWC)，再厌氧发酵，产生62 g/L D-乳酸，转化率达0.9 g/g，体积生产速度达1.0 g/(L·h)[3]。日本研究者[4]发现E. coli的pflA或pflB基因突变株，在微好氧条件下可以由葡萄糖生产大量的D-乳酸。进一步构建pykF、ppc、pflA、pta和adhE单基因删除突变菌株，表明pta、ppc基因突变也能显著提高菌株D-乳酸的产量[5]。Zhu等[1]删除了E. coli YYC202 (具有 aceEF、pfl、poxB、pps基因突变) 菌株的frdABCD基因，获得菌株ALS974，以乙酸和葡萄糖为底物生产了138 g/L D-乳酸，转化率为97%，生产强度为6.3 g/(L·h)，并可以控制琥珀酸杂酸含量在3 g/L (表3)。菌株TG114能够合成99.9%以上光学纯度的D-乳酸，该菌株在含有1 mmol/L甜菜碱的无机盐培养基中能将12% (W/V) 葡萄糖转化为118 g/L乳酸，转化率达98%[6](表3)。

同时，我们注意到，菌株 ALS974虽已具有良好的生产性能，但需要以乙酸作为发酵原料，势必增加了生产成本。菌株TG114需要添加渗透压保护剂，培养条件要求较高。此外，在产酸阶段需通入氮气来控制绝对厌氧环境，也使得工艺条件复杂，生产成本高。针对以上问题，本中心以一株生长快速的野生型E. coli CICIM B0013作为代谢途径改造的出发菌株，该菌株是本中心 (http://cicim-cu. jiangnan.edu.cn/) 前期研究中筛选得到的[7]。在本研究前期工作中以 B0013为出发菌株构建了具有ackA-pta、pps和pflB基因 (以葡萄糖为底物发酵乳酸的主要代谢反应见图1) 突变的菌株B0013-030。本研究在B0013-030的基础上删除了其琥珀酸合成途径 (frdA基因) 获得菌株B0013-040B，进而又删除了乙酸合成途径 (tdcD和 tdcE基因) 获得菌株B0013-050B。经两阶段乳酸发酵摇瓶实验，对比了野生型菌株 B0013与其突变株 B0013-030、B0013-040B和B0013-050B在无机盐培养基中，以葡萄糖为唯一碳源，生产D-乳酸的性能。并进一步将菌株B0013-040B和B0013-050B进行发酵罐发酵实验，考察它们的D-乳酸发酵性能。在发酵过程不添加特殊底物，厌氧阶段不需以氮气、氢气等惰性气体控制厌氧环境。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒与引物

菌株Escherichia coli CICIM B0013由本中心筛选、保藏 (http://cicim-cu.jiangnan.edu.cn/)，菌株B0013-030由本研究前期构建；质粒pKD46 (温度敏感型，含有阿拉伯糖启动子调控的gam、bet和exo基因，Ampr) 购于CGSC[2]，pSK-EcdifGm (含有两边带有dif位点[8]的庆大霉素抗性基因、Ampr、Gmr)由本研究前期构建。本文所用菌株、质粒及引物序列见表1。

pMD18-Tsimple、T4 DNA聚合酶为TaKaRa (大连) 公司产品，各种限制性内切酶为 Fermentas产品，Taq酶、质粒提取、纯化和胶回收试剂盒为Biodev公司产品。

1.2 D-乳酸摇瓶发酵培养方法

一级种子的制备：在LB平板上生长了24 h的单菌落接种于50 mL LB液体培养基中 (在250 mL三角瓶中)，37 ℃、200 r/min培养10 h。

二级种子的制备：离心收集一级种子菌体，并以0.1 g/L (菌体干重/培养基体积) 的接种量转接于含5 g/L葡萄糖的50 mL改良M9液体培养基中 (在250 mL三角瓶中)，37 ℃、200 r/min培养10 h。

表1 本研究中所使用的菌株、质粒和引物Table 1 Strains, plasmids and primers used in this study

图1 大肠杆菌菌株发酵葡萄糖产乳酸过程中的主要代谢反应Fig. 1 General reactions in lactate fermentation from glucose by Escherichia coli strains. pps: PEP synthase; pfl: pyruvate formate lyase; tdcE: pyruvate formate-lyase, homologous to pflB; pdh: pyruvate dehydrogenase complex; ppc: PEP carboxylase; ldhA: fermentative D-lactate dehydrogenase; poxB: pyruvate oxidase; acs: acetyl-CoA synthetase; pta: phosphotransacetylase; ackA: acetate kinase; tdcD: propionate kinase: homologous to ackA; adhE: alcohol dehydrogenase; mdh: malate dehydrogenase; fumABCD: fumarate hydratase; frdABCD: fumarate reductase; aceA: isocitrate lyase; aceB: malate synthase A.

摇瓶发酵：以 5%接种量将二级种子转接于含有5 g/L葡萄糖的50 mL新鲜改良M9培养基中，37 ℃、200 r/min好氧培养菌体12 h；厌氧发酵产酸阶段，补加15 g/L葡萄糖和40 g/L CaCO3，37 ℃静置培养36 h。

一级种子培养基为LB液体培养基，二级种子培养基和发酵培养基都为补加了一定浓度葡萄糖的改良M9液体培养基。改良M9培养基的基本成分为：每升M9液体培养基[10]补加1 mL 1 mol/L MgSO4和1 mL微量元素母液。微量元素母液成分 (g/L)：2.400 FeCl3·6H2O，0.300 CoCl2·6H2O，0.150 CuCl2·2H2O，0.300 ZnCl2，0.300 Na2MO4·2H2O，0.075 H3BO3，0.495 MnCl2·4H2O。

1.3 D-乳酸发酵罐发酵培养方法

一级种子的制备：在LB平板上生长了24 h的单菌落接种于50 mL LB液体培养基中 (在250 mL三角瓶中)，37 ℃、200 r/min培养10 h。

二级种子的制备：离心收集一级种子菌体，并以0.1 g/L (菌体干重/培养基体积) 的接种量转接于含5 g/L葡萄糖的150 mL改良M9液体培养基中(在500 mL三角瓶中)，37 ℃、200 r/min培养9 h。

发酵罐发酵：将上述二级种子液转接于7 L发酵罐 (Bioflo110；New Brunswick Scientific Co.，Edison，NJ)，接种量为0.062 g/L (菌体干重/培养基体积)，发酵培养基为改良M9培养基，接种后发酵液总体积为3 L，初始葡萄糖浓度为30 g/L。第一阶段为好氧菌体生长阶段，初始空气通量为3 L/min，搅拌转速为 200 r/min，将此时溶解氧浓度标定为100%，发酵过程中调节通气量直至7 L/min，并将搅拌转速与 DO值关联来维持溶解氧浓度大于30%；用NH4OH和10% (V/V) H2SO4维持pH值为7.0，并控制发酵温度为37 ℃。当菌体浓度在600 nm的吸光度 (OD600) 达到30时，即进入第二阶段，厌氧发酵产酸阶段。在第二阶段中，将通气量调零，搅拌转速控制为100 r/min，用250 g/L Ca(OH)2悬浊液控制pH值为7.0，发酵温度控制为37 ℃，并补加浓度为600 g/L的葡萄糖，补加的葡萄糖干物质量为140 g，当发酵过程中残糖浓度降为10 g/L左右，再次补加相同量的葡萄糖，共补加 4批次，当所有4批补加的葡萄糖耗尽后即结束发酵。

1.4 分析方法

1.4.1 菌体量测定方法

菌体密度采用浊度法间接测量，通过 OD600来表示，并通过下列公式换算为菌体干重 (X)：

X (g/L)=0.382×OD600。

1.4.2 葡萄糖测定方法

葡萄糖用SBA-40C葡萄糖生物传感仪 (山东省科学院生物研究所) 进行分析。

1.4.3 进行高效液相分析的发酵液样品预处理方法

用 5% (V/V) 样品体积的浓硫酸将发酵液样品酸化，释放由 Ca(OH)2中和的有机酸，离心去除CaSO4沉淀后用等体积 100 g/L三氯乙酸沉淀蛋白质，经0.45 μm微孔滤膜过滤后进行高效液相产物分析。

1.4.4 有机酸测定方法

有机酸含量用高效液相色谱进行分析，检测器为UV (210 nm) 检测器，色谱柱为SH1011 (Shodex)，流动相为0.01 mol/L H2SO4，流速为0.6 mL/min，柱温50 ℃。

1.4.5 乙醇测定方法

乙醇含量用高效液相色谱进行分析，检测器为示差检测器，色谱柱为SH1011 (Shodex)，流动相为0.01 mol/L H2SO4，流速为0.6 mL/min，柱温50 ℃。1.4.6 乳酸光学纯度测定方法

乳酸光学纯度用高效液相色谱进行分析，检测器为UV (254 nm)检测器，色谱柱为CLC-L手性柱(Advanced Separation Technologies Inc.)，流动相为5 mmol/L CuSO4，流速为1.0 mL/min，柱温为室温。

2 结果

2.1 大肠杆菌CICIM B0013-030菌株frdA基因的删除

以FrdA1、FrdA2为引物，PCR扩增大肠杆菌的 frdA基因片段 (1.6 kb)，PCR产物克隆入质粒pSKsym 的 SmaⅠ酶切位点中，获得重组质粒pSKsym-frdA’。该重组质粒用PstⅠ酶切 (去除frdA基因中部部分序列)，并用T4 DNA聚合酶使粘性末端平滑化，再克隆入 dif-Gm 片段 (重组质粒pSK-EcdifGm用SmaⅠ酶切，胶回收1.0 kb大小片段，即获得 dif-Gm 基因片段) 获得重组质粒pSKsym-frdA’::difGm。质粒pSKsym-frdA’::difGm用EcoRⅠ酶切，并胶回收1.3 kb frdA’::difGm基因片段。以该片段为模板，再次用引物FrdA1、FrdA2 PCR扩增，获得高浓度的frdA’::difGm突变盒基因片段，经试剂盒纯化后电击转化含有辅助质粒pKD46并经2 mmol/L L-阿拉伯糖诱导的目的菌株B0013-030，在庆大霉素抗性平板筛选具有frdA基因突变的转化子，并用引物FrdA1、FrdA3菌落PCR验证，转化子B0013-041B (B0013-030，frdA::difGm) 获得1.8 kb大小电泳图谱 (图 2)。该转化子进一步在无抗生素的LB液体培养基中传代培养，使 Gm基因两端的dif位点重组，环化去除Gm基因，并挑选庆大霉素抗性丢失的菌株用引物FrdA1、FrdA3菌落PCR扩增frdA突变基因进行验证，转化子 B0013-040B (B0013-030，frdA::dif) 获得0.8 kb大小电泳图谱(如图2)，而原始菌株B0013 PCR产物电泳图谱大小为2.1 kb (图2)，即菌株B0013-030的frdA部分基因已被dif序列替换。

图2 frdA基因突变转化子的PCR鉴定电泳图Fig. 2 Identification of frdA gene mutants by PCR. 1: B0013 PCR product; 2: B0013-041B PCR product; 3: B0013-040B PCR product; 4: λ DNA/Pst I marker.

2.2 大肠杆菌CICIM B0013-040B菌株tdcDE基因的删除

以TdcDE1、TdcDE2为引物，PCR扩增大肠杆菌的 tdcDE基因片段 (2.8 kb)，PCR产物克隆入pMD18-Tsimple载体中，获得重组质粒T-tdcDE’。该重组质粒用Hind III酶切 (去除tdcDE基因中部部分序列)，并补平粘性末端，克隆入dif-Gm片段获得重组质粒T-tdcDE’::difGm。质粒T-tdcDE’::difGm用引物TdcDE1、TdcDE2 PCR扩增，并胶回收1.5 kb tdcDE’::difGm基因片段。将tdcDE’::difGm突变盒基因片段电击转化含有辅助质粒 pKD46并经 L-阿拉伯糖诱导的目的菌株B0013-040B，在庆大霉素抗性平板筛选具有tdcDE基因突变的转化子，并用引物TdcDE3、TdcDE2菌落 PCR验证，转化子 B0013-051B (B0013-040B，tdcDE::difGm) 获得1.5 kb大小电泳图谱 (图3)。该转化子进一步在无抗生素的LB液体培养基中传代培养，去除 Gm基因，并挑选庆大霉素抗性丢失的菌株用引物TdcDE3、TdcDE2菌落PCR进行验证，转化子B0013-050B (B0013-040B，tdcDE::dif) 获得0.6 kb大小电泳图谱 (图3)，而原始菌株B0013 PCR产物电泳图谱大小为2.9 kb (图3)，即菌株B0013-030的tdcDE部分基因已被dif序列替换。

图3 tdcDE基因突变转化子的PCR鉴定电泳图Fig. 3 Identification of tdcDE gene mutants by PCR. 1: λ DNA/Pst I marker; 2: B0013 PCR product; 3: B0013-051B PCR product; 4: B0013-050B PCR product.

2.3 D-乳酸摇瓶发酵实验

菌株B0013、B0013-030、B0013-040B和B0013-050B经两阶段摇瓶发酵实验，各产物含量和乳酸转化率如表2所示。野生型菌株B0013经两阶段摇瓶发酵实验，获得9.6 g/L D-乳酸，乙酸和琥珀酸是主要的副产物，此外还有甲酸、丙酮酸和乙醇积累，由于这些副产物的大量合成，厌氧阶段乳酸转化率仅为 51.0% (厌氧阶段乳酸转化率=厌氧阶段乳酸产量/厌氧阶段葡萄糖消耗量，表2)。菌株B0013-030丙酮酸积累量因其分解代谢支路的受阻而有所增加，乙酸产量显著降低了 63.5%，不形成甲酸，副产物合成量的减少为乳酸的合成节约了碳源，D-乳酸产量比出发菌株提高了31.9%，厌氧阶段乳酸转化率因而增加了45.1% (表2)。然而菌株B0013-030所合成的琥珀酸副产物含量仍高达乳酸含量的11.9%，本文在菌株 B0013-030中删除了琥珀酸合成途径(frdA基因)，使得琥珀酸含量显著降低了80.8%， D-乳酸产量进一步增加了 12.2%，转化率升高了16.5% (表2)。为了进一步降低菌株B0013-040B的乙酸含量，我们一次性删除了其tdcD和tdcE基因，获得菌株B0013-050B。tdcDE基因的删除将乙酸的含量降低了 23.8%，而对其他产物的含量无显著影响 (表 2)。在摇瓶发酵实验中各菌株乙醇的合成量很少，且无显著差异 (表2)。

2.4 菌株CICIM B0013-040B发酵罐发酵D-乳酸性能

经两阶段发酵罐发酵实验，菌株B0013-040B好氧生长约9.5 h，OD600达到30，厌氧发酵阶段仅耗时26 h (图4A)。

好氧菌体生长阶段即积累了 5.6 g/L的乳酸和8.8 g/L的乙酸，进入厌氧发酵阶段后快速产生乳酸(图 4A)，发酵结束时发酵液中葡萄糖耗尽，乳酸含量高达114.5 g/L。在厌氧阶段初期副产物乙酸继续产生，并在发酵过程中逐渐被消耗，发酵结束时乙酸含量达5.4 g/L，成为发酵液中的主要副产物。其他副产物如琥珀酸、丙酮酸和乙醇的含量在整个发酵过程中都较低，发酵液中不能检测出甲酸，如图4A和表3。此外，菌株B0013-040B厌氧阶段葡萄糖对乳酸的转化率为 83.0%，乳酸单位体积生产速率达4.6 g/(L·h) (厌氧阶段乳酸体积生产速率=厌氧阶段乳酸产量/发酵液体积/厌氧发酵时间，表3)。

2.5 菌株CICIM B0013-050B发酵罐发酵D-乳酸性能

在两阶段发酵罐发酵实验中，菌株B0013-050B的好氧生长速度受到tdcDE基因突变的影响，好氧生长至OD600值为20左右时，溶氧浓度突然上升，菌体生长速度开始变慢，同时对中和剂氨水的需求量增加，表明产酸速度开始变快，此时菌体微环境更类似于厌氧发酵，因此OD600值达到25.4即人工将其转入厌氧发酵阶段。厌氧发酵阶段耗时18 h (图4B)，显著快于B0013-040B。

表2 各菌株两阶段摇瓶发酵D-乳酸性能比较Table 2 Comparison of E. coli strains for D-lactate production using shake flask fermentationa

图4 两阶段发酵罐发酵产D-乳酸过程中各产物的变化Fig. 4 Productions of organic compounds during the two-phase lactate fermentation. The figure shows concentrations of lactate (■), acetate (○), succinate (▲), pyruvate (□), and ethanol (◆). (A) Strain B0013-040B. (B) Strain B0013-050B.

表3 同型D-乳酸发酵重组大肠杆菌比较Table 3 Comparison of D-lactate producing E. coli strains

好氧菌体生长阶段有少量的乳酸及副产物产生，乙酸的合成量仅为0.3 g/L。进入厌氧发酵阶段后快速积累乳酸 (图 4B)，厌氧发酵末期高浓度乳酸、Ca(OH)2中存在的杂质以及有粘性的葡萄糖使得发酵液产生结晶，因此提前结束发酵，菌株B0013-050B发酵结束时发酵液中尚存在一定浓度的葡萄糖，乳酸含量达111.9 g/L，厌氧阶段乳酸单位体积生产速率高达6.2 g/(L·h) (表3)。发酵液中无甲酸积累，仅有少量的琥珀酸、丙酮酸和乙醇积累，如表 3。通过抑制好氧阶段乙酸的生成量，发酵结束时，菌株B0013-050B仅积累0.4 g/L乙酸。

2.6 发酵液D-乳酸光学纯度的测定

经高效液相分析，发酵液中D-乳酸与L-乳酸含量之比大于99.9%。

3 讨论

在厌氧条件下，大肠杆菌糖酵解途径中产生的大量NADH不能通过电子传递链进行氧化，须通过还原丙酮酸为还原末端产物 (如乳酸、乙醇、琥珀酸等) 来释放，实现NAD+的回复利用并维持氧化还原平衡 (如图 1)。然而，野生型大肠杆菌中大量还原末端产物的产生减少了用于生成乳酸的碳架，并降低了乳酸产品的化学纯度，增加了后续纯化成本。

菌株B0013-030中，编码乙酸激酶 (ackA) 和磷酸转乙酰酶 (pta) 基因的删除大幅度降低了副产物乙酸合成 (表2)；编码丙酮酸甲酸裂解酶基因 (pflB)和编码磷酸烯醇式丙酮酸合酶基因 (pps) 的删除阻断了与乳酸脱氢酶竞争利用丙酮酸的代谢途径 (图1)，代谢流在丙酮酸代谢节点进行重新分配，使得乳酸合成代谢流增加，乳酸产量、转化率得到大幅度提高 (表2)。

大肠杆菌厌氧条件下琥珀酸产生的主要途径为：葡萄糖经EMP途径形成磷酸烯醇式丙酮酸，再进一步代谢为草酰乙酸 (由磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化；ppc基因编码)、苹果酸、富马酸，并形成琥珀酸。ppc基因删除能够完全去除琥珀酸的合成，但突变菌株不能在以葡萄糖为唯一碳源的无机盐培养基上生长[1,11]。富马酸还原酶催化富马酸合成琥珀酸 (图1)，由A、B、C、D四个亚基构成，frdABCD基因编码。本研究只删除了frdA基因即使得该酶所催化的代谢途径阻断。所获得菌株B0013-040B的琥珀酸合成量显著降低了，仅经乙醛酸循环等代谢途径合成少量的琥珀酸以维持其生长需求。

大肠杆菌以葡萄糖为底物厌氧发酵过程中，主要经丙酮酸甲酸裂解酶途径合成乙酰-CoA，进而经磷酸转乙酰酶途径合成乙酰磷酸，乙酸主要是由乙酰磷酸经乙酸激酶合成的 (图 1)。虽然菌株B0013-040B已具有ackA、pta和pflB基因突变，其乳酸发酵产物中，乙酸含量仍高达5.4 g/L。tdcD基因编码丙酸激酶，同时具有乙酸激酶的活性；与tdcD基因相邻且同一操纵子的tdcE基因与pflB基因相似[12-13]，编码 α-酮戊二酸裂解酶，同时具有丙酮酸甲酸裂解酶的活性。在菌株KJ091中删除tdcDE基因使得乙酸含量降低了50%[14]。本文删除tdcDE基因后，所获得的菌株B0013-050B乙酸的含量比菌株B0013-040B降低了93.2%。说明除ACK、PTA途径外，TDC途径是乙酸合成的主要途径。

即使在氧供应充足的情况下，如果糖消耗速率大于将还原力重新氧化的速率，则细胞的代谢行为更类似于在厌氧条件下的，这一现象被称为过速代谢。虽然这一机制尚不清楚，较为合理的解释称：由乙酰-CoA合成乙酸不产生 NADH，而乙酰-CoA流经TCA循环会产生8个NAD(P)H和2个FADH2，所以合成乙酸可以被视为一个降低NAD(P)H积累的方式[15]。菌体在对数生长中后期快速生长，耗糖速率高，乙酸在这一时期大量产生 (如菌株B0013-040B)。而菌株B0013-050B因具有tdcDE基因突变，不能通过形成乙酸来降低 NAD(P)H的合成，促使细胞内NADH/NAD+的水平进一步增加，菌体代谢因此类似于在厌氧条件下的，生长速度开始变得缓慢，溶解氧浓度逐渐上升。然而，溶解氧浓度的上升相对于细胞内的变化是有滞后性的，当人为将发酵阶段转变为厌氧阶段时，细胞内的 NADH/NAD+的水平已积累到很高，以至于菌体快速将葡萄糖转化为乳酸，来降低NADH/NAD+的水平。而NADH的产生与糖酵解是同步的，高的产酸速率带来高的耗糖速率和NADH产生速率，如此形成良性循环。因此，菌株B0013-050B 在厌氧阶段的乳酸生产速率远快于B0013-040B的。

与表3所列出的相关研究比较，本文所构建的重组菌株 B0013-050B未经过基于菌体生长速度的代谢进化[16]即具有较快的生长速度，且利用无机盐培养基，以葡萄糖为唯一碳源，不需添加特殊底物和保护剂，合成光学纯度的D-乳酸，发酵周期较短，乳酸产量较高，副产物含量能够维持在较低水平，具有较优良的生产性能。

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