口蹄疫非结构蛋白研究进展

朱咏梅，朱来华，郑小龙，王宫璞，王 琰

（1.青岛出入境检验检疫局，山东 青岛 266000；2.山东出入境检验检疫局，山东 青岛 266002）

FMD是由FMDV引起的偶蹄类动物烈性传染病，世界动物卫生组织（OIE）将其列入必须通报的动物疫病。该病传播快、宿主范围广、发病率高，对畜牧业发展构成极大威胁。近年来我国畜牧养殖业发展迅速，口蹄疫是重大的潜在威胁。与发达国家通常采取的扑杀政策不同，发展中国家普遍采用免疫的方法来控制该病。因此，如何快速、可靠地区分免疫动物和感染动物，对于FMD的防制以及国际贸易尤为重要。

基于动物感染FMDV后，既能产生结构蛋白抗体，又能产生NSP抗体，而疫苗免疫动物主要诱导机体产生FMDV结构蛋白抗体，与结构蛋白相比，非结构蛋白的变异较少，相对保守[1]。在FMD诊断中，区分免疫动物和自然感染动物是一项十分重要的内容，鉴别自然感染动物和免疫动物也是OIE判定一个国家有无FMD流行的依据。近年来，陆续建立了检测FMDV NSP抗体的诊断方法，以区分FMDV感染动物和注射疫苗动物。以下就FMD中NSP的研究进展综述如下。

1 FMDV相关NSP的种类

FMDV的NSP是指除了衣壳蛋白1A、1B、1C、1D和它们的前体蛋白之外的所有由病毒编码但不参与病毒衣壳组成的蛋白，包括成熟蛋白L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D以及它们的前体。NSP参与病毒的复制、多聚蛋白的裂解和病毒颗粒的组装过程。其中L和3C能抑制宿主细胞的蛋白合成，在病毒蛋白的成熟裂解过程中作为蛋白酶裂解聚蛋白，2A为P1/2A间裂解提供识别序列2BC、2C、3AB和3CD形成复制复合物，为病毒RNA的合成创造条件，与装配有关[1]。

1966年Cowan等[2]发现一种病毒非结构蛋白抗原（即3D）仅与感染动物血清反应，由此建立的免疫扩散试验与动物食道咽部病毒分离技术相结合，曾被认为是一种可靠的鉴别诊断方法。但后来发现，反复接种灭活疫苗的动物体内会不同程度地产生抗3D抗体，该方法受到质疑。近年来，开始研究用其他非结构蛋白取代3D来区分注苗动物和感染动物。Berger等[3]研究发现，血清中存在NSP抗体可以作为感染FMD康复动物的标志，若血清中同时存在至少2种NSP抗体（3D抗体除外）就可以断定该动物感染过FMDV，但如血清中不存在一种或所有的NSP抗体，并不能肯定该动物从来就没有感染过FMDV。

Rodriguez等[4]对感染FMDV的猪和疫苗接种猪体内的NSP免疫原性及特异性进行了研究，发现3ABC抗体是由活FMDV在体内诱导产生的，因此3ABC最适合用于鉴别FMDV感染猪和疫苗接种猪，并指出抗3ABC抗体在感染后2周即可检测到。Lubroth等[5]发现，血清中2C和3ABC抗体的存在可作为区分FMD恢复动物（带毒者）和疫苗接种动物。Mackey等[6]指出，2C、3A、3ABC 抗体的存在也可以作为鉴别感染和疫苗接种动物的指标，并且对于牛和猪血清，3ABC是最为可靠的、可单独使用的指标。抗3ABC抗体在感染后早期就出现，并且在血清中维持可被检测水平的时间比任何其他的NSP都长[7]。

20世纪90年代以来，各国研究者通过对2C、3A、3ABC等FMDV非结构蛋白的深入研究，发现针对F3ABC、3B的血清抗体水平可以作为区分免疫动物和感染动物的指标。在现代疫苗加工过程中，2C、3A、3B和3C等非结构蛋白会被去除，因此免疫动物体内不会产生针对NSP的抗体，只会诱导产生针对病毒衣壳蛋白的抗体。而当动物感染FMDV并出现病毒复制后，无论表现为临床或亚临床症状，动物都会出现2种抗体，一种是针对衣壳蛋白的抗体，一种是针对NSP的抗体，后者可以用来区分免疫动物和感染动物[8]。

2 通过测定NSP抗体区分感染动物和注射疫苗动物的研究进展

建立检测NSP抗体试验的目的之一是试图区分感染动物和注射疫苗动物。OIE的动物卫生法典规定要求：宣布无FMD的国家应进行血清学监测，以证明本国确实无FMDV感染。FMDV结构蛋白抗体的存在是曾接触过FMDV的证据（通过疫苗接种或感染），因此，在非疫苗接种的国家，检测病毒结构蛋白抗体已经成为一种血清学监测方法。在非接种疫苗或近期内不用疫苗或已停止接种疫苗的国家将检测NSP抗体作为间接评估病毒在畜群中活动的标志。

在区分感染动物与注射疫苗动物之前，还必须先了解FMDV的NSP的体液免疫和细胞免疫两类免疫应答的特性。Bergerman[9]等报道了利用放射免疫沉淀法（RIP）对有限数量动物进行研究的结果，阐述了NSP在注射疫苗动物和感染动物体内的免疫应答。

2.1 体液免疫

在小核糖核酸病毒科中只有FMDV和心病毒有编码前导蛋白L的基因。因此，检测FMDV感染动物L抗体应当是高度特异的。遗憾的是，L蛋白的免疫原性比其他的NSP低。不是所有感染过的动物都产生L抗体，即使产生应答，持续时间也很短暂。L抗体应答并结合其他NSP应答的检测是FMDV感染的证据。感染动物产生2B抗体，并证明它含有B细胞表位的肽，但至今尚未建立能用于检测2B抗体的重复性好的ELISA。Meyer[10]等报道了用杆状病毒表达的2C作为抗原的ELISA。Mezencio[11]等检测了各种来源的注射疫苗动物和感染动物血清中的2C抗体，发现注射疫苗动物的2C抗体很少有阳性，而FMDV感染动物2C抗体则全部是阳性。Mezencio[11]等亦证明，牛和猪2C抗体的衰退比3ABC抗体衰退要快，并且注射疫苗的牛体偶尔也能检测到2C抗体。

已发表的资料表明，检测3ABC多肽抗体是确定感染的标记之一，许多研究者都认同这一观点。在组成3ABC多聚蛋白的3种蛋白中，3A的免疫原性最好，3C诱导的免疫反应较弱，但它包含在3ABC多肽中能提高3ABC抗原作为感染标志的可靠性。有些研究报告还进一步证实了3ABC抗原作为感染标记的可靠性。Mackey等[6]比较了3ABCELISA和EITB鉴别感染动物的效果，认为3ABCELISA是鉴别感染动物的有效方法，3ABCELISA阳性血清或可疑血清可用EITB进一步确证。Brochi[12]等利用3ABCELISA检查1996年在巴尔干地区流行的FMDVA型血清，有临床症状的动物都检出了3ABC抗体，而注射过疫苗的动物，不管疫苗的来源、佐剂类型、接种次数，3ABC抗体都是阴性。

3D蛋白是NSP中免疫原性最好的一个，虽然只测定3D抗体不能区分感染动物和注射疫苗动物，但它仍可作为早先接触过非特异FMDV抗原的指标。在3ABC阳性动物血清中检出3D抗体为证明早先感染进一步提供了证据，反之，检测到FMDV结构蛋白和3D抗体，则是早先注射过疫苗的标志。

2.2 细胞免疫

FMDV感染可诱导细胞免疫，但产生免疫应答的细胞成分尚不清楚，有报道通过体外增殖和感染动物体内延迟过敏反应（DTH），能够证明T2细胞对FMDV NSP，特别是2B、2C和3D的免疫应答。DTH反应有可能用于区分感染动物和注射疫苗动物的研究正在进行之中。

3 NSP抗体诊断应用及发展前景

1991年，Neitart[13]等建立了酶联免疫电转印试验（EITB）技术，可以同时检查血清中几种NSP抗体。不久，Bergerman[9]证实，检测FMDVNSP抗体水平可以用于区分感染和免疫动物。Bergmann等比较了分别以3A、3B、2C、3D和3ABC作为诊断抗原，应用间接ELISA试验检测感染牛的敏感性和准确性，结果以3A、3B和3ABC为抗原检出的结果与病毒分离和EITB的检出结果一致，尤其是3ABC的效果最好。在单个NSP中，研究者一致认为多聚蛋白3ABC抗体是检测FMD预先感染的最可靠单一指示器，并推荐检测3ABC抗体的试验。

Berger等[3]研究发现，血清中存在NSP抗体可以作为感染FMD康复动物的标志，若血清中同时存在至少2种NSP抗体（3D抗体除外）就可以断定该动物感染过FMDV，但如血清中不存在一种或所有的NSP抗体，并不能肯定该动物从来就没有感染过FMDV。Rodriguez等[4]对感染FMDV的猪和疫苗接种猪体内的NSP免疫原性及特异性进行了研究，发现3ABC抗体是由活FMDV在体内诱导产生的，口蹄疫疫苗免疫的动物很少有3ABC、3AB等NSP抗体，3ABC和3AB检测方法常用于检测动物是否感染口蹄疫病病毒。其中3ABC最适合用于鉴别FMDV感染猪和疫苗接种猪，抗3ABC抗体在感染后2周即可检测到，并且在血清中维持可被检测水平的时间比任何其他的NSP都长，适用于大批量的动物普查，用于找到隐性感染口蹄疫病毒的动物。

目前学者确认以生物工程技术制备的3ABC作为抗原的ELISA方法是区分FMDV自然感染和疫苗免疫动物的理想方法，疫苗生产工艺，在病毒纯化过程中去除了绝大部分非结构蛋白，因此灭活疫苗免疫动物体内没有病毒非结构蛋白3ABC抗体产生，而自然感染动物体内既有结构蛋白抗体又有非结构蛋白3ABC抗体，因此，检测FMDV非结构蛋白3ABC抗体的ELISA方法不但可以检测隐性感染动物，而且可以区分自然感染动物和灭活疫苗免疫动物。美国率先推出了FMDV非结构蛋白ELISA诊断试剂盒，在许多国家和地区进行区域性试验，并在美国、阿根廷和中国台湾省申请了专利。

在国际贸易中，实施FMD血清学检验的目的是鉴别动物是否有带入FMDV的危险，由于已感染的牛能够形成持续性感染，不管是否接种过疫苗，所有血清阳性的牛都认为有危险，并将其剔除。对于进出境检疫样品的血清学检验，要强调试验绝对敏感，但对于流行病学监测，强调试验的特异性，若FMD疫苗含有残留的微量NSP，也能诱导产生特异的抗体，特别是重复注射疫苗后尤为明显，试验要求能够可靠地确定动物是否已感染了FMDV，不管它们是否注射过疫苗。在野外检测重复注射疫苗动物血清时，偶尔也能检测到NSP抗体阳性或可疑抗体。Bergerman等[9]还发现，年龄大的、重复注射疫苗的动物偶尔在EITB试验中出现1条或1条以上NSP阳性反应带，对所有 5条带（2C、3B、3ABC、3D）都发生反应的非常罕见，只有1头年龄最大的牛出现过这种情况。已发表的研究结果表明，检测FMDVNSP（非3D）抗体不是早先感染的绝对证据，还须考虑血清阳性动物的年龄和感染史。在制定检测病毒活动的血清学监测计划时，考虑动物的年龄和注射疫苗史同样重要。Bergman建议，为了避免由于注射疫苗或在以前接触过抗原产生阳性结果的问题，采样的动物应限制在2岁以下。

有学者研究了注射疫苗后再感染牛的NSP抗体应答，以确定注射疫苗NSP转阳后再接触FMDV的动物是否得到保护。Brochi等[14]证明，大多数注射疫苗的牛，在攻毒后3ABC抗体转阳，可是没有检查过这些牛的带毒状况。因此，尚不能把3ABC抗体与攻击后是否形成感染联系在一起。Sorensen等[15]和Mackay等[16]检查采自注射过疫苗然后攻毒牛的血清，发现某些注射过疫苗又进行攻击后形成持续性感染的牛NSP抗体不转阳。另有证据表明，带毒动物血清转阳与形成持续感染的水平相关，而持续感染的水平又与接种疫苗的效力有关。不管动物是否接种过疫苗，3ABC抗体的检测（通常与其它NSP中的1种或1种以上的抗体联合）是确定是否感染FMDV的证据。以畜群整体而言，检测3ABC抗体能够监测病毒在注射疫苗牛群中的活动情况。就单个动物而言，注射疫苗后呈阴性结果并不意味着该动物从来没有接触过FMDV。

因此在实际检测过程中，如仅用3ABC-ELISA单一方法，不可避免就会出现假阳性问题。所以还需要一种更特异的快速诊断方法。EITB是有酶联免疫和免疫印迹试验相结合而开发的试验，可同时检测最常见的5种非结构蛋白（3ABC，3D，2C，3B和3A）。而在灭活疫苗中，5种非结构蛋白可能同时微量存在，或可能1～2种出现较多，同时大量出现这5种非结构蛋白的可能性很低，因此判定结果时下列3种情况为阴性：（1）不出现5条印迹；（2）某一印迹不明显，浓度低于阳性对照；（3）印迹明显（等同或高于阳性）的条带不超过2条。目前，3ABC-ELISA和EITB联合检测诊断系统已由泛美地区口蹄疫诊断中心（OIE口蹄疫参考实验室）开发，广泛应用于泛美地区口蹄疫的诊断、监控，并得到OIE认可[9]。首先，应用3ABC-ELISA检测非结构蛋白3ABC抗体进行初筛，如3ABC-ELISA阳性或可疑，再用EITB检测五种非结构蛋白抗体（3ABC，3D，2C，3B和3A），如EITB仍为阳性，再用病毒分离鉴定方法进行确证。

目前，单独用血清学方法不足以鉴别持续性感染（不管是否接种过疫苗），还必须应用直接检测病原的技术。病毒分离试验虽然敏感，但获得结果要花费几日的时间。今后的研究是确定在野外和实验条件下检测病毒在注射疫苗畜群中的活动及采样的方式等。如果PCR技术进一步自动化，在短时间内能够处理大量样品，将对动物调运检疫极有价值。用附加扩增步骤的巢式PCR或利用检测PCR产物的ELISA技术能提高RT-PCR的敏感性。PCR在人医和兽医上的广泛应用促使该技术向快速、简易方向发展。毫无疑问，PCR有可能成为鉴定FMDV带毒者的可靠方法。

综上所述，检测NSP抗体试验在FMD诊断中的应用具有特别的意义。检测FMDV结构蛋白和衣壳蛋白抗体仍然是鉴别动物是否接触过FMDV抗原最敏感、特异的方法。而检测FMDVNSP抗体方法已经建立，并且极其有效。只用血清学办法不能绝对地区分自然感染与注射疫苗动物，如果动物既接种过疫苗又被感染，则大多数动物的NSP抗体呈现阳性，在动物NSP抗体阳性血清中，多聚蛋白3ABC抗体的检测是最可靠的指示器。检测其他的NSP，如L、2B、2C、3A或3ABC中的1个或1个以上的抗体，可为确定动物是否感染FMDV提供了更确实的证据。以畜群或组为单位，检测3ABC、2C和3AB抗体，能够证明注射疫苗群是否早先感染。不能把结构蛋白抗体阳性，但3ABC抗体阴性的单个动物简单地认为是注射过疫苗的动物。这样的动物还应当检查是否存在病毒，然后才能确定。只检测3D不能区分是感染动物还是注射疫苗动物，因为许多FMD疫苗能诱导产生3D抗体，结构蛋白和3D蛋白抗体阳性而其他NSP抗体阴性的动物，是早先接种疫苗的标志。今后的研究方向是建立一种方法，将检测NSP抗体的方法和检测病毒的RT-PCR结合为一体，使其能快速、可靠地鉴别是否接种过疫苗的所有感染动物。

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