食用菌领域原生质体技术研究应用浅析

2011-02-10王春晖

中国食用菌 2011年3期

王春晖

（湖南省食用菌研究所，湖南长沙 410013）

当今世界，人口急剧膨胀，资源环境日益恶化，食品和能源的供应日益紧张，农业面临着巨大压力，人们将解决食品问题的希望寄托于一场新的农业科技革命。上世纪七十年代能源危机后，唤醒了人们对农业、工业废弃物再利用的重视。食用菌是现代农业的重要组成部分，联合国粮农组织向发展中国家推荐了18种珍稀菌。大规模利用秸秆、木屑、棉籽壳等废料来栽培食用菌，已被认为是通过生物作用变废为宝的重要途径，也将是解决人类面临的食物短缺，环境污染和健康质量下降等问题的有效途径，特别是在生产力水平不太发达的发展中国家则更加重要。以生物技术为主体的现代高新技术大量应用于农业，对农业产生了广泛而深刻的影响，推动农业和农业科技向更高、更深、更广的领域发展。上世纪兴起的发酵工程技术、原生质体技术、基因工程技术等高新生物技术很快地渗透到食用菌各个领域并被广泛采用，展现了美好的发展前景。

1 原生质体技术简述

原生质体是指植物细胞（包括真菌和细菌）在酶的作用下，细胞壁被酶解后所形成的原生质球（Protoplast）。原生质球没有细胞壁，因此失去了原有细胞的固定形态，但是它依然有细胞膜、细胞质、细胞核和完整的遗传物质，是一个具有生理功能的结构单位。原生质体技术是一种以原生质体为细胞基础发展起来的细胞生物工程新技术，在植物和细菌中研究应用较早，在真菌中起步较晚。原生质体技术在食用菌领域中具有明显的开拓创新性，它包括以原生质体为主体的再生、诱变、融合、单核化和外源DNA导入转化等主要研究内容。原生质体技术在食用菌中的应用最早见于Daries和Wessels对双孢蘑菇和草菇的原生质体制备和分离。30多年来，食用菌原生质体在理论和应用上发展迅速。目前已有60多种食用菌品种成功制备出原生质体，原生质体技术食用菌品种的脱毒、提纯、复壮和育种中得到了广泛的应用和推广。

2 原生质体技术研究应用

2.1 原生质体无性再生

原生质体再生无性繁殖在食用菌的遗传育种中主要有3个方面的应用。一是进行脱毒、提纯和复壮，食用菌品种经过长期无性繁殖，会导致病菌污染，纯度不高，活性不强和退化现象，通过单细胞原生质体再生，可以达到脱毒、提纯和复壮的目的；二是从再生菌株中选育种性改良的优良生产菌株；三是应用于真菌细胞质遗传、核遗传和生理生化研究。佐木尧从金针菇的双核菌丝制备的原生质体再生无性系发现了菌落形态突变株、黄色素等生化突变株。我国在这方面也有报道。郭砚翠等[1]进行了黑木耳原生质体再生株选育高产菌株研究。何培新等[2]进行了光木耳原生质体无性系繁殖的研究。朱宏发等[3]进行了原生质体复壮平菇初探。王海英等[4]进行了原生质体技术在食用菌育种上的应用研究。研究表明，食用菌的原生质体再生无性系具有出菇能力强、产量高和早熟等优良变异。另外，原生质体的形成和再生不是一个简单的物理化学变化，而是一个生命过程，伴随一系列复杂的生命运动和优胜劣汰。原生质体再生无性系的变异机理在于去壁细胞敏感性增强，再生过程能消除与经济性状传递有关的质粒，导致次级代谢途径的变化，从而出现有利于产量性状的变异。

2.2 原生质体诱变

以原生质体为诱变对象，与常规诱变相结合，称为原生质体诱变。食用菌菌丝为多细胞，不宜作诱变材料。担孢子虽是单细胞且大多单核，但因其壁厚，诱变剂不易穿透，诱变效果不甚理想。而去除细胞壁的原生质体对外界环境非常敏感，经诱变剂处理后易发生突变，因此，食用菌原生质体诱变育种已成为食用菌原生质体育种的一种有效方法。刘国振等[5]以紫外线诱变处理筛选出增产、早熟、抗逆性强、菇型改变、效益提高的香菇菌株，该系统产生的营养缺陷型突变株，为原生质体融合研究提供了遗传标记型材料。在侧耳属和香菇属中，利用原生质体诱变获得的营养缺陷型菌株在国内外都已有不少成功的例子。原生质体诱变系统还被应用于选育无孢平菇。许囊中等[6]报道用无孢平菇菌株原生质体进行紫外线诱变处理，经拮抗试验、孢子印检测、扫描电镜和出菇试验，筛选出1株中低温型、高产、菇型好的无孢平菇突变菌株。张渊等[7]进行了刺芹侧耳原生质体诱变育种初报。与常规诱变比较，真菌原生质体诱变具有几大优点：原生质体诱变无须带任何标记，操作简便、成本低，直接选取性能优良的菌株重复诱变即可收到明显效果；原生质体诱变敏感性增强，诱变因子更直接作用于DNA，突变率提高，变异幅度增大，更易得到优良变异株，提高育种效率；原生质体是单细胞的，而且有一部分是单核的，有助于均匀地和诱变剂结合，有助于突变基因的表达，提高诱变的效果；原生质体的获得不受时间因素的限制，这使得原生质体诱变在食用菌育种中显示出巨大的活力。常规孢子诱变，孢子来源于子实体，受时间与季度限制，而原生质体可以通过菌丝体酶解随时得到。当然，在实际操作中，原生质体诱变也存在着一些同常规诱变一样不可改变的缺点。

2.3 原生质体融合

原生质体融合（Protoplast fusion）是指通过去除细胞壁后的不同遗传类型的原生质体，在融合剂的诱导下进行结合，最终达到部分或者整套基因重组，产生出新的品种和类型，也就是说原生质体融合育种技术是一种不通过有性生活史而达到遗传重组或有性杂交的育种手段。原生质体融合育种技术同基因工程技术相比，其技术难度较小，所需要的设备简单，不需要大量的药品和价格昂贵的仪器，因此，原生质体融合技术是现代生物工程中最重要的遗传操作技术之一。

原生质体融合技术研究是近几年食用真菌原生质体育种中的活跃领域，技术大致包括有原生质体的制备、遗传标记、原生质体融合及融合子的筛选等。科学研究已取得了有效的成果，得到了少数种间或者属间、科间的融合子。Masahide S[8]进行毛木耳营养突变体种间融合获得成功。肖在勤等[9]把经灭活的原生质体，以PEG为助融剂，在高钙、高pH值条件下，获得科间原生质体融合子。孙丽等[10]进行香菇和瓜哇香菇种间融合，得到2株融合子，其生长特征明显不同于亲本。李省印等[11]进行平菇种内原生质体分离与融合杂育种研究，得到种内杂融合子5株，其中有4株融合子再生出菌丝体和子实体，选育出优质、高产、高抗新菌株优生1号新品系。王春晖等（2008年）应用原生质体融合技术，选育出湘杏98融合新菌株，技术成果通过省级鉴定，新菌株生物转化率比对照菌株提高28.6%。

在融合试验中，亲本菌株多数带有缺陷遗传标记，液体培养基营养要求丰富，使菌丝体在短时间内旺盛生长。原生质体的释放量与酶解时间成正比，但酶解时间越长，原生质体的再生率越低。解决这一矛盾的方法是在酶液浓度不变条件下，加大酶液用量，缩短酶解时间。既保证有一定数量的原生质体释放，又保证原生质体有较高的生活力和再生率。酶解时要调整好两亲本的酶解时间，防止酶液去除后原生质体失活或再生壁的形成。在纯化原生质体时，应尽量除去菌丝残片，以免影响原生质体的融合和再生效果。在融合前期适当搅动增加碰撞机会，后期静止有利于融合的发生。PEG有一定的毒性，影响原生质体的再生率，加等渗液或再生液体培养基，既可降低PEG浓度，减少PEG毒性，提高原生质体的融合率。同时，控制好再生温度等环境条件，提高再生率。

在融合子的鉴定方面，同工酶分析是采用最普遍的方法。酯酶是一种普遍存在且相对稳定的酶系，其同工酶谱具有较高的多型性，可作为杂种鉴定的指标，同时木质素、纤维素酶活也可作为参考指标。较为实用的另一种鉴定方法是融合株与亲本株的拮抗试验，拮抗表现的多样性反映融合子的变异程度，同时菌株形态生长特性上的自然标记，也可以鉴别异源融合株。当然利用缺陷遗传标记或RAPD等分子标记，鉴定分析融合株更具可靠性和科学性。

2.4 原生质体单核化

单核体是异宗结合食用菌杂交育种中的基本材料，双核体单核化的方法主要有分生孢子分离、化学处理、机械分割，这些方法有一些局限性和难度。原生质体单核化是同宗和异宗结合蕈菌的普遍现象。原生质体单核体和由孢子萌发形成的单核体具有不同的遗传特性，前者可认为是亲本的无性后代，后者则是通过减数分裂的有性后代。利用原生质体单核杂交，亲本中好的性状，可以得到稳定的表达，有性孢子获得单核体杂交，亲本中好的性状就会丢失。潘迎捷[12]开展单核和同核原生质体技术在食用菌遗传育种上的应用。国内一些教学研究单位开展香菇及木耳等蕈菌原生质体再生质体单核菌丝交配分析和杂交育种的技术研究，均取得了可喜的结果。杨岱筠等[13]开展白色金针菇原生质体单核菌系的建立及其遗传特性分析。薛丽娥等

[14]运用原生质体融合技术培育香菇新品种。焦海涛等[15]报道了香菇原生质体单核体杂交方法试验，各亲本、单核体生长速度明显慢于双核菌丝，杂交株与亲本的酯酶同工酶存在着较大差异。原生质体单核化现象是原生质体技术在食用菌遗传和育种研究中的一个重要分支。单核化原生质体育种，无需经过减数分裂，有利于亲本优良性状的保存和稳定表达；无需进行孢子收集和单孢分离，亲本性状可以达到集中表达，有利于减少工作量，缩短育种时间，可以为菌根真菌等野生珍稀菌的驯化育种提供单核材料，为同宗结合的食用菌杂交育种提供了一个有效途径。由于单核原生质体具有特殊的遗传背景，在理论上是研究其基因定位和遗传性状的重要材料，在育种上形成了以单核原生质体为材料的新方向，具有广阔的应用和推广前景。

2.5 外源基因转化与导入

转化技术在微生物遗传改良、基因工程中占十分重要的地位，但大部分微生物的自然转化能力很低，特别是真核微生物几乎很少能发现自然转化。食用菌中的遗传转化已有多例成功的报道，包括糙皮侧耳、杨树菇、紫孢侧耳、双孢蘑菇等。外源DNA导入即提供供体的DNA，把它导入受体，使一定异源DNA片段整合到染色体上。在真菌尤其是食用菌中用外源DNA导入进行基因转化是一种有效的育种手段，它可以克服原生质体融合难以得到融合子的特点，又不需要一定载体及限制性内切酶，也能有效地克服属间远缘杂交的困难，有时甚至获得意想不到的效果。

外源DNA导入的方法有多种，如CaCl2/PEG介导法、显微注射法、脂质体法、电激法等，同时很多实验证明原生质体有直接吸收多种外源性物质的能力，其中包括DNA在内。Davey（1980年）用裸露的质粒DNA通过PEG和高pH作用处理烟草原生质体后，发现T－DNA已整合到细胞核中。杨虹（1990年）将苏云金芽孢杆菌与S－内霉素基因导入水稻原生质体后获得转基因植株。目前，外源基因导入食用菌的最常用方法是CaCl2/PEG介导的原生质体转化。王春晖等[16]以平杂49 DNA为供体，草菇V157为受体，用PEG、CaCl2作诱导剂，选育出草菇V157－1优良品种。王春晖[17]将湘平992 DNA导入浏阳麻菇原生质体，选育出优质、高产麻菇新品种。

3 总结和展望

笔者认为食用菌原生质体技术育种与传统的育种方法相比有3个方面的特点与优势：原生质体的形成与再生过程既是一个生命过程，也是一个引发变异和优胜劣汰的过程，涉及一系列基因与酶的变化，活力强、遗传信息完整的个体能优先再生成无性系，成为单个细胞扩繁的菌落，这些菌落酶活、生长速度、大小等形态与生理指标趋于一致，比组织分离效果好，在一定程度上能提高生物转化效率，因此，原生质体无性再生不失为一种育种手段，值得在食用菌品种提纯与复壮上推广应用；原生质体不受细胞壁的限制，能形成单核体，能吸收多种外源性物质，对外界刺激敏感性强，突变性强，为基因和遗传性状研究、诱变突变株的筛选、外源DNA的导入与转化等试验提供了良好的实验材料和新的研究方向，具有广阔的研究和应用前景，要加大研发力度，并及时转化为生产力；原生质体融合育种不受亲缘关系的影响，遗传信息传递量大，不需要详细了解双亲的遗传背景，操作方便，适用性强，可以实现远源原生质体融合，通过融合打破种间不能进行体细胞杂交的屏障，实现种间遗传物质的重组，为遗传物质的变异提供了最大的可能性，为食用菌新品种的选育提供了广阔的发展前景。

原生质体融合育种可以作为我国食用菌产业新品种研发的重点领域，同时原生质体技术在发展过程中也存在着一些问题，需要进一步改进完善，主要有几个方面：原生质体形成与再生受酶解时间、酶解浓度、钙离子浓度、整合剂、渗透压稳定剂、酶系、菌丝菌龄等多种因素的影响，原生质技术系统性强，一定要在原生质体制备、纯化和再生技术很成熟的条件下，才能取得成功，行业要对原生质体技术进行集成和熟化；原生质体融合和再生率总体不高，融合子再生率则更小，同时融合子尤其是远缘融合子存在着一定不稳定性，需要时间进行稳定性试验，要获得正向的研究结果，往往需要经过多次反复试验，因此，在原生质体育种过程中，制备、再生、筛选工作依然显得繁重，有待于进一步改进和创新；原生质体技术育种中难点和重点之一在于融合子的筛选，目前原生质体融合子选择的标记与方法主要有形态标记、生理生化指标、营养缺陷和抗药性标记等，这些标记技术尽管可行并有一定的发展，但每一种方法都有局限性，只能适用于一定的条件与范围，而且存在着一些不确定性因素的影响，需要不断改良，向分子标记方向发展，提高筛选的准确性、可靠性。

研究与应用表明，原生质体生物新技术、新方法为食用菌遗传育种、物种鉴别、核型分析、外源染色体检测、基因定位和基因转移等方面向更高、更深的领域发展奠定了坚实的基础。由于食用菌病虫害日趋严重，所以将原生质体技术和DNA分子技术结合，用分子生物学方法培养新品种已成为当代食用菌科研工作者的重任。随着食用菌技术的高新化及相应的高新技术产业化，食用菌的科研和产业将更加灿烂辉煌，生物工程和基因工程的新技术、新成果、新工艺、新产品将不断问世，前景十分广阔。

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