液相色谱质谱联用技术在中药研究中的应用进展

王宇歆，刘洪斌，李东华

中药研究手段的现代化是中药现代化最重要的组成部分，其中包括用现代科技手段对中药有效成分确定，中药的生产和质量控制，以及中药代谢过程确定等一系列的问题。其中高效液相色谱与质谱联用技术(high performance liquid chromatograph-mass spectrometer，HPLC-MS)将色谱的分离能力与高分辨光谱的表征能力相结合，不仅具有色谱的高效、准确、灵敏度高、重复性好、操作方便、使用范围广等优点，同时具有定性、定量能力强的特点，非常适合活性成分复杂、含量低的植物药研究，为中药中有效成分的定性、定量及中药代谢等问题的解决提供了强有力的工具和手段[1]。

1 质谱技术简介

质谱仪器一般由真空系统、进样系统、离子源、质量分析器和计算机控制与数据处理系统等部分组成[2]，质谱仪需要在高真空下工作:⑴大量氧会烧坏离子源的灯丝；⑵用作加速离子的几千伏高压会引起放电；⑶引起额外的离子-分子反应，改变裂解模型，谱图复杂化。

目前常用的高效液相色谱与质谱联用具有两大分类系统，一种是从质谱的离子源角度来划分，包括电喷雾离子源(electrospray ionization，ESI)、大气压化学电离源(atmospheric pressure chemical ionization，APCI)、大气压光电离源(atmosphere pressure Interface，APPI)和基质辅助激光解析电离源(matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)等[3]；另一种是从质谱的质量分析器角度来划分，包括四极杆、离子阱、飞行时间(Time-of-Flight，TOF)和傅立叶变换质谱等[4]。

从离子源角度来看，ESI适合于中高极性的化合物，特别适合于反相液相色谱与质谱联用，是目前液质联用中应用最广泛的一种离子化方式，ESI-MS的优点还在于它是一种浓度型检测器，因此可以不受样品量的限制，近几年发展起来的微喷雾和纳喷雾技术尤其适合微量样品的高灵敏度分析[5]。APCI采用电晕放电来电离气相的分析物，因此要求被分析物具有一定的挥发性，它最适合于中、低极性的中等分子量化合物，不易形成多电荷，谱图解析相对简单[6]。APPI是在大气压下利用光化作用将气相的被分析物离子化的技术，其适应范围与APCI相似，是对APCI的补充[3]。MALDI则是将样品加入到一种能够强烈吸收入射激光的基质中，通过能量转移产生样品的分子离子或准分子离子，其优点在于容易与TOF联用测定高质量数的分子，其灵敏度高，样品制备较简单，现己被广泛应于分析蛋白质、肽类、核苷酸、多糖以及合成聚合物等。但由于MALDI自身的特点，目前直接在线与HPLC联用的应用研究还相对较少[7]。

从质量分析器角度来看，四极杆是在交变电场的作用下，使某些符合要求的离子通过四极杆到达检测器，三级四极杆质谱则可以实现二级质谱功能[8]。离子阱则是首先把离子聚集到阱内，通过改变电参数把阱内离子逐个释放到达检测器，离子阱质谱具有多级质谱功能，对于解析化合物结构更为有利，但是质量准确度和分辨率不及四极杆质量分析器。对于一级质谱选择离子检测或串联质谱多反应监测时，四极杆质量分析器的灵敏度一般比离子阱高1～2个数量级，因此更适用于微量或痕量成分的定量分析[9]。飞行时间质谱是应用不同m/z离子的飞行速度不同，离子飞行通过相同的路径到达检测器的时间不同而获得质量分离，它常与MALDI联用，优点是扫描速度快、分析的质量范围宽，质量测定精确[10]。

2 液质联用技术在中药研究进展

2.1 中药成分分析 随着人们对药用植物成分的广泛深入的研究，对已知化合物的研究，在有标准品的情况下，可利用液质联用，将样品组分的保留时间、分子量信息与标准品相比较，从而快速鉴定已知化学成分；在无现成标准品的情况下，可以根据样品组分的分子量信息，特别是由串联质谱得到的特征碎片离子或中性丢失等结构信息，结合相关文献报道，从而进行快速鉴定[11]。例如，Li等[12]利用液质联用，通过对比标准品的保留时间、质谱分子量信息等对黄柏皮层中10种化学成分进行了快速鉴定。Zhang等[13]采用液质联用技术对白芷提取物的化学成分进行分析，在30min内初步鉴定了23种呋喃骈香豆精。

液质联用不仅可以快速鉴定中药中的已知化学成分，而且能快速鉴定未知化学成分。由于中药提取物中的同类化合物在化学结构很相似，因此可以对数个已知单体化合物进行质谱裂解分析，研究这一类化合物的裂解特征以及结构上的细微差异引起的裂解行为的不同，总结出基于结构特征的质谱碎裂规律，然后利用这个规律，根据这类化合物未知成分的质谱裂解特征直接推断其化学结构[14]。例如，Petsalo等[15]利用类黄酮化合物在负离子模式下，糖苷取代基位置的不同引起质谱碎裂产生的糖苷配基奇电子离子的相对丰度不同的规律，对红景天提取物进行液质联用分析，直接快速鉴定了其中的15种化合物，其中10个含量较少的化合物为首次从该植物中报道。Grayer等[16]从9种罗勒属植物中检测到了23种黄酮类化合物。其中15种组分通过对比标准品的HPLC保留时间以及质谱分子量信息得到直接确定，根据质谱裂解规律确定了1种新化学物。

因此，液质联用可以快速鉴定中药的已知或未知化学成分，对已知化合物，可以避免重复工作，对未知化合物，特别是其中感兴趣的微量活性成分，可以进行靶裂解，从而有效地指导选择性分离提取实验，加快发现先导化合物的分析速度。

2.2 中药质量控制 目前，现行的中药质量控制方法主要是对一些有效成分或特征性成分进行定性及定量分析，然而中药特有的多成分、多靶点作用模式决定了其药效并非是某几个“指标成分”或“主要成分”在起作用，而是多种成分共同作用的结果。中药指纹图谱分析是对中药及其制剂进行综合宏观分析的可行手段，能够全面反映中药内在化学成分的种类与数量，进而反映中药的质量[11]。目前，国家食品药品监督管理局要求制造商对中药注射液及其原料应用指纹图谱进行质控。这也促进了HPLC-MS技术在中药质控方面的发展。

HPLC-MS技术与常用的液相-紫外技术相比，可以提供色谱峰相对分子质量和结构信息，根据断裂的片段以及文献报道推测可能的化学结构，体现出了显著的优势。

Song等[17]利用HPLC-MSn技术，建立了银杏叶提取物的多维指纹图谱，可同时得到各个成分的保留时间、线紫外光谱图、一级质谱图(各个成分的相对分子质量)和二级质谱图(某成分的特征碎片)，使同时检测银杏叶中两类有效成分——黄酮和内酯类化合物成为可能。研究采用电喷雾离子源，负离子检测模式下，采集质谱数据，利用指纹图谱相似度计算软件，考察了15个产地的银杏叶提取物与正宗银杏提取物的相似度。HPLC-MS用于质量控制的研究，不仅仅是在指纹图谱中应用，最有意义的是对中药材、天然药材及成药中含量低，没有紫外吸收线或紫外响应值低的化合物，尤其是毒性成分进行含量测定。HPLC-MS技术分析样品不需要进行繁琐和复杂的前处理，同时得到化合物的保留时间、相对分子质量及特征结构碎片等丰富的信息，具有高效快速和高灵敏度的特点，尤其适用于含量少、无特征紫外吸收官能团的分析检测。

2.3 中药药物代谢动力学分析 药物代谢过程包括药物分子在生物系统中的吸收、分布、代谢及排泄，这些因素决定了药物能否以适当浓度到达目标部位，并停留一定时间，从而使药物的疗效得以发挥。HPLC-MS在药物代谢研究中除了可确定分子量之外，还可以根据特异性断裂规律推导出重要部分结构甚至是完整的结构。其根据是由于多数药物的代谢物保留了原形药物分子的骨架结构，因此，代谢物可能与母体药物具有相似的裂解规律，即失去一些相同的中性碎片或形成一些相同的特征离子，利用HPLC-MS可以迅速找到可能的代谢物，并鉴定出结构。

Cheng等人[18]对最常用中草药甘草进行了代谢组学研究，应用HPLC-MS确定了大鼠口服临床剂量甘草代谢物中42种血浆代谢物和62种尿代谢物，这是完全依照临床剂量进行的中草药代谢组学研究。目前,应用LC-MS进行快速高通量的代谢组学研究已成为中药药代动力学研究的热点。Xin等[19]成功建立了HPLC-MS快速测定浙贝母灌胃后大鼠血浆中贝母素、贝母酮和异贝母碱含量的方法，用于中药药代动力学研究，此方法在0.505～96.0 ng/mL范围内线性关系良好（r＞0.999）。对于复方的代谢组学研究也是LC-MS的研究趋势。Su等[20]报道应用UPLC-MS鉴定了口服少腹逐瘀汤大鼠的血浆，共鉴定16个峰，其中12个峰与标准品进行了对照，另外通过据断裂的片段以及文献报道推测了9种代谢物。

3 展望

中医药学是祖国医学几千年临床经验的结晶，是我国医学的瑰宝，但是中药活性成分复杂、代谢物在生物样品中浓度较低，且生物样品内源性杂质较多，给中药研究带来了相当大的困难。利用HPLC-MS等现代的分析手段是中药现代化、国际化的必然要求。HPLC-MS技术已经广泛地应用于中药化学成分的快速筛选、中药材鉴别、质量控制、代谢机理和动力学以及配伍规律研究等领域。HPLC-MS技术具有的高分离、高灵敏度、高选择性以及能提供丰富结构信息等一系列优点，可有效地对中药成分进行整体分析。因此HPLC-MS再加上气相色谱法-质谱和高效液相色谱-核磁谱等联用技术的补充，将会使中医药学研究上升到更高水平。

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