胰岛素抵抗对大鼠脑海马区Aβ蛋白表达的影响及认知行为学的改变

吕爱红 朱帅科 张晓曼

郑州市第一人民医院 郑州 450004

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是以学习、记忆等认知功能下降为临床特征的神经系统变性疾病,β-淀粉样蛋白(β-amyloid,Aβ)沉积是 AD的主要病理学特征。较多研究证实2型糖尿病影响认知功能,而AD被认为是一种3型糖尿病[1]。胰岛素抵抗是2型糖尿病病理机制之一,本实验通过观察胰岛素抵抗大鼠脑海马区Aβ的表达及认知功能的改变,旨在探讨胰岛素抵抗与AD的关系,为AD的发病机制提供一定的基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 4～5周龄清洁级健康雄性Wistar大鼠30只,体质量180～200 g,购于郑州大学实验动物中心。兔 Aβ40一抗(购于武汉博士德生物工程有限公司),辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(购自北京中杉金桥生物技术有限公司),血糖仪(美国强生公司产品),Morris水迷宫(北京硕林苑科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 模型制备和分组：将30只Wistar雄性大鼠,按照随机数字表法分组,每组15只。正常对照组(NC组)给予标准啮齿类动物饲料喂养,模型组给予高糖高脂饲料喂养(饲料成分：10%猪油,20%蔗糖,2.5%胆固醇,1%胆酸盐,6.5%常规饲料),诱导出胰岛素抵抗模型。

1.2.2 Morris水迷宫实验：水迷宫为一个不锈钢圆形水池,直径100 cm,高 60 cm,内置无色有机玻璃平台,平台高40 cm,在水池壁东西南北部位分别标明入水点。将平台放在西南象限正中处,迷宫中含牛奶液面高于安全平台1 cm,水温(22±1)℃,加适量奶粉使水呈乳白色,实验期间环境安静,迷宫外参照物不变。该实验历时5 d,每天上下午2个时间段,每个时间段训练4次,每次训练随机找个入水点,将大鼠面向池壁放入水池,同一次训练所有大鼠入水点相同,记录大鼠从入水找到平台的时间即逃避潜伏期。如果大鼠在120 s内没有找到平台,将其引向平台,潜伏期计为120 s。前4 d为训练期,第5天进行测试。

1.2.3 一般指标的测定：从大鼠尾静脉取血,用血糖仪检测血糖。大鼠处死前心脏取血1 mL,离心留取血浆,用放射免疫法检测胰岛素。胰岛素抵抗指数是以稳态模型的胰岛素抵抗指数 HOMA-IR=FINS(IU/L)×FPG(mmol/L)/22.5表示。

1.2.4 组织标本及切片制备：水迷宫实验结束后,用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后,开胸暴露心脏,用生理盐水100 mL灌洗左心室,可见清凉液体从已剪开的右心耳流出,用4%多聚甲醛固定后,断头取脑。冠状位切取视交叉后1～4 mm的脑组织。

1.2.5 免疫组化检测Aβ40的表达：石蜡切片常规脱蜡,脱水,枸橼酸盐(p H 6.0)抗原修复液中热修复 15 min,自然降到室温。3%H2O2孵育15 min。山羊血清封闭切片,加入一抗Aβ40(1∶100),4℃过夜,二抗及SP试剂,用PBS代替一抗作阴性对照,未出现阳性反应,各步骤均以PBS冲洗。DAB显色,苏木素复染,逐层脱水,中性树胶封片。每只大鼠取5张切片,在200倍光学显微镜下进行半定量分析,将每张切片随机摄取5个视野,图像采集后用Image-Pro Plus 6.0分析软件测定阳性物质的平均光密度值。

1.3 统计学处理 采用SPASS 13.0统计学软件行t检验,实验数据以±s表示,P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 空腹血糖、胰岛素水平及胰岛素抵抗指数 IR组大鼠胰岛素水平(28.8±2.8)IU/L,胰岛素抵抗指数5.15±0.38,显著高于NC组(13.2±3.7,2.17±0.24),差异有统计学意义(P＜0.01),而 IR组空腹血糖(5.47±0.34)较 NC组(5.59±0.36)略增高,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 Morris水迷宫实验成绩 与NC组的(30.61±10.8)s相比,IR组大鼠逃避潜伏期(78.56±9.1)s明显延长(P＜0.01)。

2.3 Aβ40蛋白表达结果 镜下观察可见 Aβ40蛋白的阳性表达物为棕黄色沉着物。NC组大鼠海马区神经元着色较浅,神经元细胞排列密集,表达呈弱阳性;与NC组相比,神经元细胞排列稀疏,IR组呈深棕黄色,染色较深,表达呈强阳性。2组Aβ40蛋白平均光密度值差异有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

胰岛素抵抗是指胰岛素维持正常血糖能力下降的现象,临床特征为高胰岛素血症,但尚未发展至2型糖尿病阶段。高脂高糖饮食诱导的胰岛素抵抗模型更接近人类的发病机制,本研究通过喂养大鼠高脂高糖饮食12周后检测2组大鼠血糖水平,差异无统计学意义,而IR组大鼠血浆胰岛素水平、胰岛素抵抗指数较正常对照组增高,差异具有统计学意义,表明胰岛素抵抗模型建立成功。本实验中采用Morris水迷宫实验观察大鼠的认知行为改变,与对照组相比,胰岛素抵抗组大鼠逃避潜伏期延长,提示胰岛素抵抗大鼠学习和记忆能力下降。有研究证实胰岛素、胰岛素受体及胰岛素敏感的葡萄糖转运蛋白选择性分布于脑内认知功能区,如海马区,胰岛素参与调节学习和记忆功能,在大鼠脑室内注射胰岛素能够提高大鼠的被动逃避能力,给AD患者静脉内注射胰岛素能改善记忆功能,因此,本研究胰岛素抵抗大鼠的认知功能下降,推测胰岛素的相对缺乏是导致认知功能下降的主要因素。

在AD发病过程中,Aβ是由 APP先后被β,γ-分泌酶先后裂解而产生,本实验应用免疫组织化学染色法检测2组大鼠脑内Aβ40蛋白表达,结果显示,Aβ40在正常组大鼠脑组织有少量表达,与正常组相比,IR组大鼠海马区Aβ40蛋白的表达均较对照组明显增多(P＜0.01)。海马区是与认知功能最密切的一个部位,目前,Aβ确切的功能尚不清楚,有实验证实,不同浓度的Aβ对神经元的影响不同,低浓度的Aβ对神经元有营养作用,高浓度的Aβ对神经元有神经毒性,使树突和轴突退缩,导致神经元减少或缺失,继而引起学习、记忆功能下降等临床症状[2]。在生理情况下,细胞浆内高尔基体和内质网运输Aβ到细胞外,当发生胰岛素抵抗时神经元细胞内糖代谢发生异常,ATP生成减少,引起神经元细胞胞浆内内质网和高尔基体功能下降,继而导致β-淀粉样蛋白在胞浆内过度沉积[3]。

综上所述,本实验从分子生物学证实胰岛素抵抗能导致认知功能下降,同时发现Aβ蛋白表达增加,因此,胰岛素抵抗可能参与了AD的发生与发展。

[1]Lester-Coll N,Rivera EJ,Soscia SJ,et al.Intracerebral streptozotocin model of type 3 diabetes：relevance to sporadic Alzheimer＇s disease[J].J Alzheimers Dis,2006,9(1)：13-33.

[2]Calabrese EJ.Amyloid beta-peptide：biphasic dose resp onses[J].Crit Rev Toxical,2001,31(4/5)：605-606.

[3]褚文政,钱采韻.侧脑室注射链脲霉素引起大鼠脑Aβ1-40和Aβ1-42表达增加[J]. 第四军医大学报,2005,26(15)：1 356-1 358.