戊型肝炎与疫苗

邵惠训

戊型肝炎是一种由戊型肝炎病毒（hepatitis E virus，HEV）引起的急性胃肠道传播的传染病。戊型肝炎的症状与甲型肝炎类似，但病死率更高，症状更重，对孕妇、胎儿、老年人和慢性肝病患者的危害更大。孕妇病死率高达15%～25%[1]，幸存的孕妇极易发生流产、早产和死胎。早在 1955年12月，印度新德里由于自来水水源受患者或动物粪便污染，引起 29 000 例黄疸型肝炎流行[2]。随后在亚洲广袤地区发生了多次戊型肝炎流行，印度、中国、缅甸和尼泊尔为高流行区。1982年前苏联学者 Balayan 等将非甲非乙型肝炎患者粪便标本，让患过甲型肝炎的志愿者口服。36 d 后，出现典型的肝炎症状。用免疫电镜技术从患者粪便标本检出圆球形病毒样颗粒，并从患者恢复期血清检出病毒抗体。1986 – 1988年在我国新疆南部地区发生了世界上最大的一次戊型肝炎暴发性流行，共发生病人 12 万例，死亡 707 例，其中孕妇 414 例，造成了重大经济损失，影响了社会安定。

戊型肝炎是人畜禽共患的疾病。黑猩猩、恒河猴、猕猴、狨猴、鼠猴、枭猴、短尾猴、食蟹猴和非洲绿猴等灵长类动物和猪、牛、羊、鹿、猫、狗、鸡、鸭和大白鼠等均对 HEV易感。从动物分离的 HEV 与从人体分离的 HEV 在基因序列上高度一致。其中恒河猴是最理想的实验动物模型。在很多地区，猪是主要的储存宿主和传染源，戊型肝炎严重危害猪和禽类养殖事业。越来越多的动物被发现对 HEV 易感，但细胞培养病毒目前尚未成功。病毒经人体和实验动物胃肠道黏膜进入血流，到达肝脏进行复制。病毒随血流扩散的同时，进入胆囊，最后从粪便排出体外。HEV 进入人体后，引起机体体液免疫和细胞免疫应答。产生的血清抗体有IgA、IgM 和 IgG。戊型肝炎发病后 1 个月，血清中有较高滴度的 IgA 抗体。发病后 5 个月，从血清中消失。IgM抗体在血清中出现较早。病毒感染后 1 周，在血清中出现，3 个月后消失。IgG 抗体在发病后 9 d 就能从血清检出，滴度高，在血清中能持续 10 多年[3-4]。

1 HEV 的基因结构、编码的蛋白与机体免疫应答

HEV 属肝炎病毒科（hepeviridae）肝炎病毒属（hepevirus），是单股正链 RNA 病毒，无囊膜，表面有纤突。20 面体对称，病毒颗粒直径为27～34 nm。病毒有实心和空心两种，有 8 种基因型。1 型主要在亚洲和非洲人群中流行，以缅甸株为代表；2 型在墨西哥和非洲尼日利亚和纳米比亚等国流行，以墨西哥株为代表；3 型能感染人和猪，分布广泛，包括发达国家，如美国和日本多见[5]，3 型再分为10 个亚型（3a～3j）；4 型在亚洲的人群和猪群中流行[6]，在我国猪群中流行的病毒主要是 4 型，也有少数3 型，4 型再分为7 个亚型（4a～4g），4 型肝炎比 3 型严重；5 型感染鸟类；5～8 型流行于欧洲。在我国以 1 型和 4 型为主。从不同地区分离到的病毒，存在明显基因差异，而同一地区来源的 HEV 的基因序列相对稳定[7]。HEV只有一个血清型。基因组长 7.3 kb，由一个 25 nt 的 5′ 端非编码区（UTR）、三个开放读码框架（ORF1、ORF2 和ORF3）和一个 65～74 nt 的末端为多聚腺苷酸（polyA）的3′UTR 组成。病毒基因组由 5′UTR 到 3′UTR 依次为5′UTR-ORF1-ORF3-ORF2-3′UTR 和 poly A 尾。ORF1 编码非结构蛋白，包括甲基转移酶、半胱氨酸蛋白酶、RNA 解旋酶和 RNA 聚合酶。ORF2 编码 660 个氨基酸的糖基化结构蛋白。ORF3 与 ORF2 有 331 nt 重叠，编码 123 个氨基酸残基的磷蛋白，能与细胞骨架蛋白和病毒衣壳蛋白结合，可能参与并调节细胞信号传达[8]。HEV 的结构蛋白主要由 ORF2 基因编码，含盖了主要抗原表位和主要抗原决定簇，带有明显信号肽序列。用 ORF2 基因表达的重组抗原免疫实验动物，能成功保护机体免受 HEV 的攻击[9]。ORF2衣壳蛋白高度保守，免疫原性强，其产生的抗体具有中和性保护作用，在机体内维持时间很长，而且是引起细胞免疫应答的主要抗原。ORF3 蛋白能刺激机体产生抗体，但此抗体在体内维持时间很短。ORF1 蛋白免疫原性很弱，又不是病毒的结构成分，其抗体不具有保护作用。介导细胞免疫应答的抗原表位存在于 ORF2 蛋白，而非 ORF3 蛋白。人体感染 HEV 后的免疫反应主要由 ORF2 蛋白引起，体液免疫和细胞免疫同时存在。肝细胞损伤与免疫反应密切相关。

2 HEV 感染实验室检测技术

2.1 免疫电镜技术（immune electron microscopy，IEM）

用常规 IEM 检测患者或实验动物的粪便和胆汁中的HEV，用标记的抗-HEV 抗体可检测肝细胞中的 HEAg。IEM 需要配置电镜等特殊设备和培训相关技术人员，患者排出病毒时间较短，病毒在外环境下又不稳定。IEM 准确性虽高，但灵敏度很低，限制了此法推广使用。

2.2 免疫荧光技术（indirect immunofluorescent assay，IFA）

从实验感染 HEV 的猕猴血清或单克隆抗体提取 IgG，经荧光素标记，用 IFA 法检测肝细胞中 HEAg，也可用免疫荧光抗体阻断法检测血清中抗-HEV。

2.3 酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）

抗原应包括当地主要结构基因编码的蛋白。应用杆状病毒为载体，在昆虫细胞（真核）表达的 ORF2 和 ORF3 结构蛋白羧基端（C 端），其抗原表位构象接近自然状态，具有很高免疫原性。用纯化的抗原蛋白包被在微量塑料板孔内，加入被检血清，然后加入抗人 IgG（γ 链）、或抗人 IgM（μ 链）、或抗人 IgA（α 链）酶结合物，再加入底物显色。分别检测血清标本中 IgG、IgM 或 IgA 抗体[10]。现已研制出第3 代 ELISA 诊断试剂，并已商品化。国内用大肠杆菌（原核）表达的抗原制备 ELISA 试剂盒，也能取得良好检测效果。用原核或真核表达的 ORF2 和 ORF3 抗原蛋白，对急性期血清有较强活性，但对恢复期血清反应性较差。ELISA 已成为HEV 感染的诊断常规检测技术。

2.4 蛋白印迹试验（Western blot assay，WBA）

其灵敏度和特异性均较 ELISA 为高。将聚丙烯酰胺凝胶上的 HEV 融合蛋白转移到硝基纤维膜上，与被检血清中的 IgG、IgM 或 IgA 作用，加入抗人 IgG（γ 链）、抗人 IgM（μ 链）或抗人 IgA（α 链）酶结合物，再加入底物显色。

2.5 逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）

检测患者血清和粪便中的 HEV RNA。先从被检标本中提取 RNA，逆转录为cDNA，在相应引物引导下进行基因扩增，其产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，置紫外灯下观察，通过与标准分子量的 DNA 比较，作出结果判断。在我国流行的 HEV 基因是 1 型和 4 型，根据这两型序列的保守区域设计的引物，检测 HEV RNA 的灵敏度高于通用引物。本法灵敏度高，特异性强，但在操作过程中易发生实验室污染而出现假阳性结果。也可用实时荧光定量RT-PCR 检测 HEV RNA，其比 RT-PCR 灵敏 10～100 倍。

2.6 核苷酸序列分析（nucleic acid sequence analysis）

从患者血清提取 HEV RNA，通过 RT-PCR 扩增 ORF2区 cDNA 片段，对扩增产物进行纯化。采用 Sequence Version 2.0 DNA 序列分析试剂盒，以同位素 γ-32P 末端标记引物，经双脱氧核苷酸 DNA 链末端终止直接测序法，测定扩增产物核苷酸序列。此法用于病毒分型、传染源探索和分子流行病学研究。

3 HEV 感染的流行特征

3.1 传染源

人和灵长类动物、家畜和家禽都可作为传染源。猪是人类 HEV 感染的病毒存储库，是主要传染源和动物宿主[11]。曾从屠宰场污水、猪圈外排水道标本分离出病毒。亚临床型感染者是戊型肝炎的主要传染源。潜伏期末期和急性期早期的患者传染性最强。戊型肝炎潜伏期比甲型肝炎更长。

3.2 传播途径

3.2.1 经水传播 水源被患者粪便或动物粪便污染，常引起暴发性流行。历史上几次大的流行都与水源被污染有关。

3.2.2 经食物传播 食物在生产、加工和流通过程中被病毒污染，可引起家庭内和集体食堂内的小型暴发。猪肉、猪肝、鹿肉和海产品能携带病毒，食用未煮熟的猪肉、猪肝、鹿肉和海鲜都能引起发病[12]。2009年颁布的《食品卫生法》首次将戊型肝炎列为食品从业人员健康体检的必检项目。

3.2.3 人与人之间传播 人感染后，从粪便排出病毒时间较长，病毒在自然界不易被灭活。人与人之间可通过粪口途径肠道传播或日常生活接触传播。2007 – 2009年在乌干达难民营的戊型肝炎疫情中，HEV 发生了人与人之间的传播。没有通过性传播的报道[13]。

3.2.4 垂直传播 怀孕妇女感染病毒，病毒通过胎盘使胎儿感染。印度曾报告，孕妇 HEV RNA 阳性，其新生儿100%发生急性戊型肝炎。

3.2.5 经血液传播 输入含有 HEV 的血液，使受血者发生戊型肝炎。病毒血症时间很短，但输血不是主要传播方式。

3.2.6 媒介传播 苍蝇和蟑螂等节肢动物将粪便中的病毒带到食物上造成疾病传播。

3.3 易感人群

人群普遍对 HEV 易感。儿童感染 HEV，多为隐性感染；成人则多显性感染。病后有一定免疫力。

3.4 流行病学特征

3.4.1 地区分布 戊型肝炎是一种世界性传染病。在世界很多国家和地区有过散发或暴发。印度新德里在 1955年发生水型流行后，每隔数年都要发生流行，并扩散到整个印度次大陆。1991年2月和 4月，在印度坎普尔发生了7.9 万例病人的大流行。据历史记载，发生万人以上的暴发已有 9 次之多。在非洲尼罗河流域，散发肝炎中 HEV 是主要致病因子。在美、英、日等发达国家旅游者到疫区旅游，感染了病毒，回国后发病[14]，也可由当地的动物传播而引起的散发病例。在我国大部分省区都有过本病的散发或暴发流行的报道。

3.4.2 性别和年龄分布 散发时，男性发病多于女性。发病以青壮年为主。

3.4.3 季节分布 有明显季节性，雨季多见。洪水后易发生流行。

4 HEV感染的预防

4.1 一般性预防措施

采用切断传播途径为主的综合性预防措施。加强饮用水卫生管理，保护水源。改善供水条件，保证安全用水。加强环境卫生监督和食品卫生监督，改善居住条件，合理处理人畜禽粪便，防止粪便污染水源和周围环境。加强卫生宣传教育，养成良好的卫生习惯，提倡喝开水，不喝生水。不要食用半生不熟的毛蚶和海蟹等贝壳类水产品。孕妇要远离戊型肝炎患者。加工猪肉、海产品时要做到生熟分开。到疫区旅行时，要特别注意饮食卫生。

4.2 疫苗免疫

接种疫苗是预防戊型肝炎最主要的措施。目前正在研制的疫苗有基因工程疫苗、DNA 疫苗和重组蛋白疫苗等[15-16]。

由国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心（厦门大学夏宁邵团队）等单位联合研制的戊型肝炎疫苗取得了重大成果。病毒基因来源于 HEV 基因 1 型，抗原片段选用HEV 结构蛋白 ORF2，选用大肠杆菌（原核）表达系统。大肠杆菌表达系统制备的疫苗在人群中免疫已经受了 20多年考验，在安全性上没有出现过问题。此疫苗再现了 HEV主要中和表位，具有优异免疫原性，能刺激机体产生高效价中和抗体。该团队阐明了 HEV 中和表位的结构基础，成功利用大肠杆菌表达系统获得了戊型肝炎病毒颗粒，解决了基因工程疫苗免疫原性偏低的难题，使重组疫苗正式进入产业化进程。研究前后历时 5年，经灵长类动物保护性试验和III 期临床 12 万名志愿者参加的试验证实，国产戊型肝炎疫苗安全有效，安全性指标达到美国和欧盟的最高标准。在注射疫苗一年内，使用安慰剂的受试者中有 15 人感染了戊型肝炎，而使用疫苗的人中无一人感染病毒。人工免疫后，没有发现疫苗有严重毒副作用[17]。该疫苗生产厂房已在福建厦门海沧生物医药产业园完成建设，一旦获得国家药监部门批准，即可组织生产，满足市场需求。戊型肝炎疫苗在中和表位、类病毒颗粒结构和大肠杆菌表达工艺等核心环节均拥有发明专利和完整的自主知识产权。这种疫苗一旦上市，将成为我国第一个原创基因工程病毒疫苗，世界上第三个基因工程疫苗。跨国疫苗生产企业对合作开发该疫苗的国际市场表示了浓厚兴趣。

Purcell 等[18]应用昆虫细胞/杆状病毒载体表达 ORF2蛋白片段，通过内切酶将衣壳蛋白依次进行切割，发现62 kD 和 56 kD 片段保护性能良好，56 kD 片段也很稳定。经恒河猴试验，56 kD 重组蛋白制成的疫苗预防效果良好。葛兰素-史克公司（GSK）用此重组疫苗在尼泊尔军队近2000 名志愿者中采用双盲随机试验，其中半数人接种疫苗，半数人接种安慰剂。疫苗有效率达到 95.5%，未发现不良反应。但用昆虫细胞表达系统制成的疫苗以往尚无在人群中免疫的成功报道。因此，此疫苗要进入临床尚有待时日。

5 结语

戊型肝炎是一种急性胃肠道传染病，又是人畜禽共患的疾病。戊型肝炎的流行与当地经济状况和卫生习惯密切相关。我国是戊型肝炎高流行区，加强戊型肝炎的防治工作成为当前迫切的任务，采用切断传播途径为主的综合性预防措施可控制该病流行。我国已研制成功高效、安全、具有完整知识产权的疫苗，这种疫苗一旦获得批准上市，将成为我国第一个原创基因工程病毒疫苗。人们期待国产疫苗在未来戊型肝炎预防中发挥应有的作用。

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