Aβ结合乙醇脱氢酶与阿尔茨海默病

王明宇，杨 宇，吴 江

近年来，线粒体功能障碍(Mitochondrial dysfunction)对包括阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)在内的中枢神经系统退行性疾病的影响日益引起科研人员的关注。Aβ结合乙醇脱氢酶(Aβ binding alcohol dehydrogenase，ABAD)是一种能与β-淀粉样肽(β-amyloid peptide，Aβ)特异性结合的线粒体酶，诸多的研究结果显示ABAD与AD的发生、发展有着密切关系，本文就其研究进展综述如下。

1 线粒体损伤与AD

线粒体损伤对中枢神经系统的影响日益引起人们的重视。研究发现，在与年龄相关的神经系统退行性疾病，包括阿尔茨海默病、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、Friedrich 共济失调(Friedrich ataxia，FRDA)，都能够发现线粒体功能障碍的证据［1］。线粒体被称为真核细胞的“动力工厂”(power houses)，其基质和内膜处含有三羧酸循环的酶类和多种呼吸链复合体，是细胞能量代谢的主要结构。Rhein等［2］培养了三联(含APPsw、PS2和tau)转基因AD鼠并进行蛋白质组学分析，结果发现，与对照组比较，有24种蛋白水平显著下调，其中1/3为线粒体相关蛋白。研究发现，线粒体损伤是AD的早期指标，其相关指标的改变早于病理学改变［3］。然而，这些改变是AD的原因还是结果，尚需进一步研究论证。AD时线粒体的主要改变有:(1)三羧酸循环相关酶，如丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)、α 酮戊二酸脱氢酶(αketoglutarate dehydrogenase，KGDH)等活性显著下降［4，5］;(2)呼吸链复合体活性降低，ATP合成减少［6］;(3)电压依赖型阴离子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)受损;(4)线粒体源性过氧化氢和超氧化物产生增加等。

在临床或动物研究中，这些变化可以通过应用正电子发射断层摄影技术(positron emission tomography，PET)得以反映［7～9］，通过对局部脑组织生化代谢的观察，可以有效地评价认知功能下降的程度。

2 β-淀粉样肽与AD

β-淀粉样肽是APP的代谢产物之一，由39～43个氨基酸残基组成，是构成老年斑核心和血管壁沉积物的主要成分。研究发现，加入micromolar水平的Aβ就能够通过多种机制直接损伤神经元的结构和功能［10，11］。以往认为，Aβ存在于神经元之外，通过由可溶状态到不溶状态的转变，引发一系列细胞损伤过程，最终导致AD的发生。近些年来，随着研究的不断深入，越来越多的证据证实了Aβ在神经细胞内的存在［12，13］。进一步发现，细胞内Aβ与线粒体损伤和氧化应激反应密切相关。1997年，应用酵母双杂交技术，Yan等［14］发现了一种位于线粒体基质内并可以与Aβ特异性结合的乙醇脱氢酶，并最终将其命名为Aβ结合乙醇脱氢酶(Aβ binding alcohol dehydrogenase，ABAD)。ABAD 是由 261个氨基酸组成的线粒体酶，由Xp11.2染色体HADH2基因编码。ABAD的转录产物在正常人组织中几乎无所不在，其中在肝脏和心脏中表达最多，在脑组织则主要在神经元中表达。

3 ABAD与AD

3.1 ABAD 生理功能

生理状态下，ABAD通过与NAD或泛醌还原系统结合参与细胞内的电子链传递和氧化还原过程。研究证实，ABAD在维持细胞内环境稳定和对抗应激中发挥保护作用。体外研究发现，作为短链脱氢酶超家族成员，ABAD能够可逆性地催化一系列NAD/NADH依赖的氧化还原反应，其底物非常广泛，包括线性乙醇、类固醇类(如17β-雌二醇)、S-乙酰乙酰辅酶A和β-羟丁酸等［15，16］。但生理条件下ABAD的催化作用在线粒体中并非处于主导地位。例如，ABAD和D-β-羟丁酸脱氢酶(D-b-hydroxybutyrate dehydrogenase)都能够催化线粒体D-β-羟丁酸，但是后者与D-β-羟丁酸反应的Vmax大约是ABAD的1000多倍。也就是说，当体内局部内环境稳定时，ABAD对β-羟丁酸的代谢作用微乎其微。然而，当机体内环境处于缺血或营养缺乏状态，即当β-羟丁酸成为维持代谢稳态的主要底物时，ABAD表现出显著的催化活力。研究人员用去除葡萄糖、以β-羟丁酸作为主要能量底物的培养液培养COS细胞，发现培养2～4d后出现细胞活力丧失和ATP水平迅速下降。而在同样条件下，过表达ABAD的COS细胞则较好地保持了细胞活力和ATP浓度。随后在培养基中加入［13C］D-β-羟丁酸并进行核磁共振分光检测(Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy，NMR spectroscopy)研究，发现在过表达ABAD的COS细胞中，乙酰辅酶A在三羧酸循环中的水平明显升高［16］。另有研究发现，ABAD可以具有与线粒体伴侣分子cyclophilin D结合的能力。cyclophilin D是一种肽基脯氨酰顺反异构酶，当其转移至线粒体内膜时可被激活，引起线粒体膜通透性转换孔(membrane permeability transition pore，MPT)［17］开放，破坏线粒体功能。ABAD 与 cyclophilin D［18～20］结合后可以抑制其向线粒体内膜的转移，从而起到保护细胞的作用。

另一方面，当编码动物或人的ABAD基因发生缺陷时，可以发现ABAD对生物体的生存与发育具有极其重要的作用。当果蝇的ABAD同系物scully基因发生点突变时，可以发现其生殖能力严重下降，显微研究显示突变的精母细胞胞质中出现脂质包涵体，伴有线粒体数量显著减少，体积变小并出现线粒体嵴肿胀［21］。Lenski等［22］报道了一个在 ABAD 192位残基发生同义突变的家族，该突变使该家族四代成员ABAD表达水平降低，并出现伴X染色体遗传的精神迟滞、手足徐动症和行为异常等症状。

3.2 ABAD在AD中的作用

实验数据表明，ABAD在AD中表达明显增多。用特异性抗ABAD抗体对尸检脑组织进行Wsetern blot分析时发现，AD患者ABAD蛋白的表达水平明显高于对照组。形态学研究发现，发生AD时，ABAD在脑组织神经元，特别是Aβ聚集附近处表达升高。Lue等应用免疫印迹法发现，ABAD在AD脑颞叶和海马中的表达比对照组分别高28%和40%。而不受AD影响的部位，如小脑，其ABAD表达与对照组没有明显差异。应用共聚焦显微观察和免疫金电镜技术研究发现，Aβ和ABAD共同定位与受AD影响的脑组织的线粒体基质中［23］。为明确线粒体中Aβ-ABAD的相互作用给神经元带来的影响，研究人员培养了过表达mAPP和人ABAD(Tg mAPP/ABAD)的转基因小鼠［23，24］，实验证实了 Aβ 和ABAD在Tg mAPP/ABAD小鼠线粒体中的相互结合。在对神经元中的研究中发现［25］，Aβ和ABAD显著加重了Aβ诱导的氧化应激和神经毒性。在水迷宫实验中，Tg mAPP/ABAD小鼠与Tg mAPP小鼠相比，前者表现出更为严重的学习和记忆损害。在出生后4.5～5个月时，当Tg mAPP小鼠、Tg ABAD小鼠和非转基因小鼠学习和记忆能力尚表现正常时，Tg mAPP/ABAD小鼠已经表现出了严重的学习和记忆损伤。在Tg mAPP/ABAD小鼠8～10个月龄时，检测其海马CA1层区域性兴奋性突触后电位，可以发现其基础突触传递和长时程增强的损伤。以上结果均证实ABAD加重了Aβ诱导的毒性作用。

免疫印迹实验发现，在AD脑组织匀浆和线粒体提取物中，Aβ和ABAD可以结合成一个38KD的复合体。而在对照组中，这种复合体含量极少［25］。体外结合研究表明，Aβ1-42、Aβ1-40和Aβ1-20都可以以剂量依赖的方式与ABAD结合，而Aβ25-35不能与ABAD结合，这说明ABAD与Aβ之间的结合并不是非特异性的。也提示Aβ可能是通过其N末端结合 ABAD，而保留其 C末端，使之能与更多的 Aβ结合［23］。利用高分辨率结晶摄影技术(High-resolution crystallography)对Aβ-ABAD复合体进行研究发现，在Aβ存在的条件下，NAD辅助因子失去了与ABAD结合的能力，这说明Aβ使ABAD结构发生了异常改变。Aβ与ABAD的结合诱导了ABAD天然结构中与其活性密切相关的 LD、LE、LF环和NAD结合部位发生大量的结构畸变。进一步发现，与NADABAD的结晶相比较，LD环的结构异常是Aβ-ABAD复合物所独有的。到目前为止，ABAD是唯一可以与Aβ结合的NAD依赖的短链脱氢酶/还原酶(SDR)超家族成员。研究人员发现，与其他SDR成员相比，ABAD的LD环中包含一个特有的插入序列(残基95-113)，这个独特的插入序列被认为是Aβ的识别位点。为了进一步证实LD环对Aβ结合的特异性，研究人员通过包含该区域(92-120残基)的人ABAD肽(ABAD-DP)，应用表面细胞质基因组共振技术来检测它是否具有抑制Aβ与完整ABAD结合的能力。实验结果表明，ABAD-DP能够抑制Aβ40和Aβ42与完整 ABAD的相互结合，而含有相同氨基酸成分，但序列相反的肽ABAD(120-92)或ABAD反向肽(ABAD reversed peptide，ABAD-RP)则被证明不具有这种抑制能力。这些数据说明，ABAD的LD环对于ABAD同Aβ的结合是至关重要的［23］。

上述实验表明，ABAD可以加剧 Aβ的毒性作用，而ABAD-DP可以通过特异性地结合Aβ，避免Aβ-ABAD复合体的形成，发挥神经保护作用。利用基因融合技术，研究人员在ABAD-DP的N末端融合HIV-1 TAT蛋白的膜转导域，使其能够穿过细胞膜，以利于在细胞内表达［26，27］。免疫细胞化学实验发现该融合肽ABAD-DP可以进入到神经元线粒体中。进一步发现，ABAD-DP加入到Tg mAPP/ABAD小鼠的神经元培养基后，抑制了神经元的氧化应激损伤，特别是抑制了超氧阴离子和过氧化氢的产生，而ABAD-RP组没有出现这种改变。不同的实验证实，ABAD-DP可以显著减少Aβ诱导的神经元毒性作用，减少线粒体细胞色素c释放、ROS的产生和神经元的凋亡［23，24］。这说明，干扰ABAD-Aβ的相互作用，能够保护Aβ介导的线粒体和神经元损伤。

综上，不难看出Aβ结合乙醇脱氢酶是一把“双刃剑”。在Aβ不存在时，ABAD对机体发挥多重保护作用。在应激条件下，这种保护作用尤为显著。作为一种多功能酶，ABAD的保护作用涉及多种机制，如对多种底物的催化作用，对异亮氨酸和支链氨基酸的分解代谢，对糖代谢和呼吸链的维持等，实验表明，ABAD的过度表达改善了缺血和帕金森病动物模型的病理损害。然而，当ABAD与过量的Aβ发生接触时，这些对细胞的保护作用发生了戏剧性地逆转。体外研究表明，在纯化的ABAD中加入micromolar水平的Aβ40就能够抑制它的催化活性。转基因动物亦研究证实，Tg APP/ABAD双转基因鼠的认知下降程度和病理学损害都要明显重于Tg APP单转基因鼠。ABAD与Aβ的相互作用使ABAD结构发生畸变，失去了同NAD结合位点，ABAD活性被抑制，丧失了催化同多种底物的能力和对异亮氨酸与支链氨基酸的分解代谢作用。这种改变将导致:(1)产生大量有害的中间代谢产物，例如MHB等。这些中间代谢产物的积聚，干扰了三羧酸循环的正常过程，破坏了线粒体呼吸链的稳定，导致呼吸链复合体，特别是复合体 IV(cytochrome Oxidase，COX)活力下降，引起ATP产生不足;(2)ABAD与Aβ的相互作用可能取代了其与cyclophilin D的结合，导致后者转位至线粒体内膜，引起线粒体膜通透性转换孔(MPT)开放，破坏线粒体的正常结构和功能;(3)还有学者认为ABAD的失活影响了其对雌激素类物质的代谢，从而影响后者的神经保护作用。

最终，这些改变都会引起线粒体功能障碍，产生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，并激活一系列级联反应，触发细胞凋亡途径，最终导神经元死亡。但是到目前为止，精确的机制还未能完全阐明，尚有待于进一步探索。

4 展望

对ABAD的深入研究，也为我们治疗AD提供了新的思路。我们认识到，抑制Aβ和ABAD的相互作用，就能够达到神经保护的作用。在这一点上，不同的实验室进行了有益的尝试［28，29］。将ABAD-DP作为药物亦为一种有效可行的治疗方式［30］。但目前存在的问题是，合成的短肽存在价格昂贵、半衰期短的缺点，以至于不能高效特异地与Aβ42结合而发挥其作用，从而限制了其临床应用。我们课题组构建了融合ABAD-DP和人硫氧化还原蛋白1(human thioredoxin-1，hTRX)的慢病毒载体，实现了其在细胞内稳定表达，并证实了其对PC12细胞的神经保护作用［29］。应用基因技术，使治疗肽以一种经济、有效、稳定、安全的方式发挥治疗作用，将为未来阿尔茨海默病等神经系统变性疾病的治疗带来希望。

［1］Moreira PI，Zhu X，Wang X，et al.Mitochondria:a therapeutic target in neurodegeneration［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1802(1):212-220.

［2］Eckert A，Schulz KL，Rhein V，et al.Convergence of amyloid-beta and tau pathologies on mitochondria in vivo［J］.Mol Neurobiol，2010，41(2-3):107-114.

［3］Yao J，Irwin RW，Zhao L，et al.Mitochondrial bioenergetic deficit precedes Alzheimer’s pathology in female mouse model of Alzheimer’s disease［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(34):14670-14675.

［4］Perry EK，Perry RH，Tomlinson BE，et al.Coenzyme A-acetylating enzymes in Alzheimer’s disease:possible cholinergic ’compartment’of pyruvate dehydrogenase［J］.Neurosci Lett，1980，18(1):105-110.

［5］Gibson GE，Sheu KF，Blass JP.Abnormalities of mitochondrial enzymes in Alzheimer disease［J］.J Neural Transm，1998，105(8-9):855-870.

［6］Parker WD Jr，Filley CM，Parks JK.Cytochrome oxidase deficiency in Alzheimer’s disease［J］.Neurology，1990，40(8):302-303.

［7］Wolfe N，Reed BR，Eberling JL，et al.Temporal lobe perfusion on single photon emission computed tomography predicts the rate of cognitive decline in Alzheimer’s disease［J］.Arch Neurol，1995，52(3):257-262.

［8］Silverman DH，Small GW，Chang CY，et al.Positron emission tomography in evaluation of dementia:Regional brain metabolism and longterm outcome［J］.JAMA，2001，286(17):2120-2127.

［9］Higuchi M，Maeda J，Ji B，et al.In-vivo visualization of key molecular processes involved in Alzheimer’s disease pathogenesis:Insights from neuroimaging research in humans and rodent models［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1802(4):373-388.

［10］Loo DT，Copani A，Pike CJ，et al.Apoptosis is induced by beta-amyloid in cultured central nervous system neurons［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(17):7951-7955.

［11］Casley CS，Canevari L，Land JM，et al.Beta-amyloid inhibits integrated mitochondrial respiration and key enzyme activities［J］.J Neurochem，2002，80(1):91-100.

［12］Wertkin AM，Turner RS，Pleasure SJ，et al.Human neurons derived from a teratocarcinoma cell line express solely the 695-amino acid amyloid precursor protein and produce intracellular beta-amyloid or A4 peptides［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90(20):9513-9517.

［13］Nunomura A，Tamaoki T，Tanaka K，et al.Intraneuronal amyloid beta accumulation and oxidative damage to nucleic acids in Alzheimer disease［J］.Neurobiol Dis，2010，37(3):731-737.

［14］Yan SD，Fu J，Soto C，et al.An intracellular protein that binds amyloid-beta peptide and mediates neurotoxicity in Alzheimer’s disease［J］.Nature，1997，389(6652):689-695.

［15］Yan SD，Shi Y，Zhu A，et al.Role of ERAB/L-3-hydroxyacyl-coenzyme A dehydrogenase type II activity in Abeta-induced cytotoxicity［J］.J Biol Chem，1999，274(4):2145-2156.

［16］Du YS，Zhu Y，Stern ED，et al.Amyloid beta-peptide-binding alcohol dehydrogenase is a component of the cellular response to nutritional stress［J］.J Biol Chem，2000，275(35):27100-27109.

［17］Crompton M.The mitochondrial permeability transition pore and its role in cell death［J］.Biochem J，1999，341(2):233-249.

［18］Muirhead KE，Borger E，Aitken L，et al.The consequences of mitochondrial amyloid beta-peptide in Alzheimer’s disease［J］.Biochem J，2010，426(3)255-270.

［19］Du H，Guo L，Fang F，et al.Cyclophilin D deficiency attenuates mitochondrial and neuronal perturbation and ameliorates learning and memory in Alzheimer’s disease［J］.Nat Med，2008，14(10):1097-1105.

［20］Du H，Yan SS.Mitochondrial permeability transition pore in Alzheimer’s disease:cyclophilin D and amyloid beta［J］.Biochim Biophys Acta，2010，1802(1):198-204.

［21］Torroja L，Ortuño-Sahagún D，Ferrús A，et al.scully，an essential gene of Drosophila，is homologous to mammalian mitochondrial type II L-3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase/amyloid-beta peptide-binding protein ［J］.J Cell Biol，1998，141(4):1009-1017.

［22］Lenski C，Kooy RF，Reyniers E，et al.The reduced expression of the HADH2 protein causes X-linked mental retardation，choreoathetosis，and abnormal behavior［J］.Am J Hum Genet，2007，80(2):372-377.

［23］Lustbader JW，Cirilli M，Lin C，et al.ABAD directly links Abeta to mitochondrial toxicity in Alzheimer’s disease［J］.Science，2004，304(5669):448-452.

［24］Takuma K，Yao J，Huang J，et al.ABAD enhances Abeta-induced cell stress via mitochondrial dysfunction ［J］.FASEB J，2005，19(6):597-598.

［25］Chen JX，Yan SD.Pathogenic role of mitochondral amyloid-beta peptide［J］.Expert Rev Neurother，2007，7(11):1517-1525.

［26］Schwarze SR，Ho A，Vocero-Akbani A，et al.In vivo protein transduction:delivery of a biologically active protein into the mouse［J］.Science，1999，285(5433):1569-1572.

［27］Aarts M，Liu Y，Liu L，et al.Treatment of ischemic brain damage by perturbing NMDA receptor-PSD-95 protein interactions［J］.Science，2002，298(5594):846-850.

［28］Xie Y，Deng S，Chen Z，et al.Identification of small-molecule inhibitors of the Abeta-ABAD interaction［J］.Bioorg Med Chem Lett，2006，16(17):4657-4660.

［29］Yang X，Yang Y，Wu J，et al.Stable expression of a novel fusion peptide of thioredoxin-1 and ABAD-inhibiting peptide protects PC12 cells from intracellular amyloid-beta［J］.J Mol Neurosci，2007，33(2):180-188.

［30］Yao J，Du H，Yan S，et al.Inhibition of amyloid-beta(Abeta)peptide-binding alcohol dehydrogenase-Abeta interaction reduces Abeta accumulation and improves mitochondrial function in a mouse model of Alzheimer’s disease［J］.J Neurosci，2011，31(6):2313-2320.