耐药结核病分子诊断技术研究进展

张军

结核病（tuberculosis，TB）是严重危害人类健康的慢性传染病，是目前传染病中威胁人类健康的头号杀手。耐药结核菌株的产生和播散，尤其是耐多药菌株的出现，已成为新世纪结核病控制的三大难题之一。耐药结核病尤其是耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR－TB）和广泛耐药结核病（extensively drug－resistant tuberculosis，XDRTB），是21世纪全球所面临的最为严重的公共卫生问题之一，MDR－TB则有可能使结核病再度成为“不治之症”，遏制耐药结核病已经成为非常迫切的研究课题。

分子生物学是指从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律的一门学科。医学分子生物学是其中的一个重要分支，它以疾病为中心，用分子理论和技术来研究人类疾病的预防、诊断、治疗和发病机制等。分子生物学的发展为研究结核病耐药性及结核病的传播和流行开辟了一条新的途径。笔者就耐药结核病的分子生物学研究、结核病耐药快速检测方法及基因分型技术的研究进行了概述。

耐药结核病的概念

1992年6月美国疾病预防控制中心（CDC）发表的有关耐药肺结核的文章中，正式提出MDR－TB的概念。2006年，世界卫生组织（WHO）出版了《WHO耐药结核病规划管理指南》［1]，规范了耐药概念：（1）单耐药（mono－resistance）：结核分枝杆菌对1种一线抗结核药物耐药；（2）多耐药（polyresistance）：结核分枝杆菌对不包括同时耐利福平、异烟肼在内的1种以上的一线抗结核药物耐药；（3）MDR－TB：是指患者排出的痰液中结核分枝杆菌至少对异烟肼和利福平2种抗结核药物产生耐药的结核病［2]。当实验室药敏报告结核分枝杆菌菌株对异烟肼、利福平耐药，或经WHO标准复治方案（2HREZS／1HREZ／5HRE）治疗，仍然痰菌阳性，即可判断为 MDR－TB［3]。

2006年3月24日，美国CDC首次提出广泛耐药结核病（extensively drug－resistant，XDR）的概念，即对异烟肼、利福平耐药，并且至少对6类二线抗结核药（氨基甙类、多肽类、氟喹诺酮类、环丝氨酸、硫胺类、对氨基水杨酸钠）中3类药物耐药的结核病［4]。同时对任何氟喹诺酮类药物耐药，以及至少对1种二线抗结核注射剂（卷曲霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素）耐药。2006年10月在日内瓦会议上 WHO将XDR－TB定义为：在 MDR－TB的基础上，还对氟喹诺酮类药物中的1种以及至少对以下3种注射药物：卷曲霉素、卡那霉素和丁胺卡那霉素中的1种产生耐药的结核病［3，5]。XDR目前在世界范围内最受关注，对社会、人类造成的危害也最大，在世界各国均有流行，是目前最为严重的一种结核病，治愈率很低，病死率极高［6]。

结核分枝杆菌耐药机制

随着分子生物学诊断技术的进展，抗结核药物的耐药机制逐渐被阐明。结核分枝杆菌产生耐药性主要是由不合理用药引起的结核分枝杆菌内抗结核药物作用靶基因突变所致，突变导致结核分枝杆菌耐药的自然和独立发生。具有先天耐药突变的少量菌株在合理的耐多药结核病治疗期间很容易治愈。不充分治疗和单药治疗会导致耐多药菌株增殖，最终导致临床上耐药菌株的显著增加。近年国内外研究报告指出，耐药结核分枝杆菌临床分离株药物靶编码基因发生突变，与耐药性密切相关，是结核分枝杆菌耐药性的主要分子机制。

结核分枝杆菌的耐药分子机制研究发现，其对异烟肼（isoniazid，INH）的耐药性主要是由于过氧化氢－过氧化物酶的编码基因（katG）突变或缺失或烯酰基还原酶编码基因（inhA）突变以及烷基过氧化氢酶C编码基因（ahpc基因）的突变［7]；结核分枝杆菌耐受利福平（rifampicin，RFP）主要是由于编码RNA聚合酶的rpoB基因突变，使RFP与RNA聚合酶亲和力明显减小所致，现已知96%～99%的RFP耐药性是由于rpoB基因中81bp核心区域的突变所引起［8]；链霉素（stréptomycin，SM）的耐药主要是由于核糖体30S亚基S12蛋白的编码基因（rpsl）和／或16SrRNA编码基因（rrs）突变［8]；embB 基因突变是乙胺丁醇（ethambutol，EMB）耐药性产生的主要原因，其次是embA基因突变；结核分枝杆菌耐受吡嗪酰胺（pynaziamide，PZA）主要是由于其吡嗪酰胺酶编码基因（pncA）发生突变，使吡嗪酰胺酶活性丧失，不能将PZA转变成活性型所致；编码DNA螺旋酶A亚单位的gyrA基因发生突变是结核分枝杆菌耐受喹诺酮类药物的共同机制。耐丁胺卡那霉素（阿米卡星，Amikacin，Amk）和卡那霉素（kanamycin，Km）的结核分枝杆菌中，ns基因突变为（67.4%），最常见的突变是1401位点A→G单碱基置换（60.5%）［9]，少数分离株为（1402位）C→T 或 A、（1484位）C→T，这些突变主要发生于高水平耐药株，32.6%的耐Km分离株未发现ns基因突变，可能还存在其他耐药机制。卷曲霉素（capreomycin，Cm）和紫霉素（viomycin，Vio）在结构上相似，结核分枝杆菌对Cm和Vio耐药是由于tlyA基因（编码rRNA修饰酶2′－O－甲基转移酶）和ns基因突变所致，其中tlyA基因突变是耐药性产生的重要原因。结核分枝杆菌基因ethA和ethR与乙硫异烟胺耐药有关［9]。

但是并不是所有耐药菌株均与相应基因突变有关，如部分临床耐INH株约10%～20%未检测到KatG、inhA基因改变，但存在编码烷基过氧化氢还原酶亚单位的ahpC基因突变。少数耐RIF菌株并无rpoB突变，同时在少数敏感株组3%检测到rpoB基因突变，提示RIF耐药尚有其他机制［10]。

TB耐药的主要机制是由于耐药基因如rpsL、rpoB、katG、pncA、embB等突变所致，部分由于碱基缺失或插入所致，可能与遗传相关［11]。大多数的耐多药菌株是各种药物作用靶分子的编码基因逐步突变累积所致，而且各种突变之间存在一定的关联，即染色体多个相互独立基因自发突变的逐步累加是耐多药的分子基础，还未发现由单一突变引起的耐多药菌株［10]。Morris等［12]研究表明，55%的耐多药结核分枝杆菌同时存在rpoB、rpsl和katG基因突变。

目前国内外耐药结核分枝杆菌的分子生物学检测方法

随着分子生物学的发展，尤其是PCR技术的问世，建立于PCR基础上的突变检测技术也不断涌现。利用分子生物学检测方法来研究基因突变与耐药性的关系，为耐药性的快速测定奠定了基础。

1.DNA直接测序技术（DNA sequencing）：是检测结核分枝杆菌耐药基因突变最直接、可靠的方法，是其他分子生物学方法的基础。它利用PCR法扩增待测耐药基因，产物纯化或克隆化后取DNA片段直接测序，其碱基序列与标准敏感株的同一DNA片段比较异同，寻找碱基突变的位置和分布。该方法具有高通量、自动化程序高、自动数据处理等特点，已成功地应用于检测rpoB、ndh、katG、rrs、rpsL等［13－15]位点的突变，24～48h即可提供精确序列，还可发现新的突变位点及应用于流行病学研究。但该法需在专门实验室进行，操作烦琐，费用昂贵，因此限制了它在临床推广应用，国内外学者多用该方法作为评价其他检测方法的参考。另外新一代DNA测序技术焦磷酸测序技术也开始用于基因多态性和耐药基因的检测，但该技术目前只能分析20～40bp的短序列，尚需进一步改进。

2.PCR－单链构象多态 性分析 （polymerase chain reaction－single strand conformation polymorphism，PCR－SSCP）：其原理是在某一条件下，单链（ss）核酸在溶液中会形成一定的二级结构，其碱基的组成会影响二级结构的形成。利用DNA单链构象具有多态性的特点，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，以无突变的DNA序列为对照，比较待测DNA与对照DNA在凝胶中迁移率的改变，就可判定待测序列中有无突变。与测序技术相比，PCR－SSCP操作简单、快速、敏感、特异，成为使用较广泛的检测耐药结核菌突变技术之一，如检测rpoB、katG、rpsL 基因［13－15]等。但由于受检测 DNA片段长度、胶的浓度、缓冲液的离子强度及电泳时的温度等影响，并且SSCP还不能给出突变的具体位置和突变性质，只能用于基因突变的筛选，因此限制了它的实际应用。

3.PCR－异源双链形成 法 （PCR－universal heteroduplex generator，PCR－UHG）：Williams等［16]创立了在6h内获得快速检测结核分枝杆菌RFP耐药性的方法：先用巢式PCR扩增特异的rpoB基因片段，再与根据结核菌rpoB基因Rif区合成的通用异源双链扩增子UHG（universal heteroduplex generator）探针杂交，如果标本中的结核菌rpoB基因无突变，则形成同源双链构象，电泳后呈1条区带；有突变，则形成异源双链构象，电泳后除出现代表同源双链构象的区带外还出现其他条带，确定其是否有RFP耐药性。此方法对涂片染色阳性、未经治疗的患者尤为适合。值得注意的是，PCR－UHG是依据rpoB基因Rif区的核苷酸变化来确定其耐药性的，少数标本有耐药表现型（用BACTEC检测），但不能查到其基因型变异，其耐药机制可能是在Rif区外，或不在rpoB基因。Thomas等［17]应用该方法检测RFP耐药菌株，敏感度和特异度分别为83.0%和98.2%。

4.PCR－限制性片段长度多态性 （PCR－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）：因为基因突变，在限制性内切酶酶切DNA片段时，其长度会发生变化，电泳得到其多态性变化。Nachamkin等［18]进行了一系列试验来检测结核菌的耐药性，RFLP用于katG和rpsL基因突变的检测，其特异度达100%，但其灵敏度却只有28%；而检测rpoB基因的异源双链分析达到76%的灵敏度和97%的特异度。此法特异度较高，能分析已知序列是否存在某个位点的突变，但不知突变的性质。由于不是所有突变都可以获得或者限制性酶切位点的缺失，而限制了其在临床上的应用［19]。

5.PCR－反向斑点杂交方法（PCR－reverse dot blot，PCRRDB）：该方法的原理是应用生物素或地高辛修饰的特异引物扩增DNA，特异寡核苷酸探针同PCR产物杂交与否来决定耐药相关基因突变的存在状态。该方法优势在于可以直接对临床标本进行检测，同时能够一次对多种耐药基因进行检测并确定耐药基因突变的部位和性质，快速精确，具重复性，技术要求简单，标本可批量处理，因此极具推广应用的潜力。目前，比利时的Innogenetics公司和德国的Hain Lifescience公司已推出PCR－RDB MTB检测试剂盒，用于分析RFP耐药基因型，获得较好的结果［20]。

6.基因芯片技术：其原理是将已用荧光标记的核苷酸靶序列（待测菌的DNA或RNA）与固定在芯片上的基础探针杂交，通过激光共聚焦荧光扫描或电荷偶联摄像机对每个探针分子的荧光信号强度进行检测，以此来获取待测标本分子的数量和序列信息。DNA芯片在确定PCR产物序列方面具有广阔的应用前景，它的出现为仅用一次杂交确定大量序列提供了可能性。该方法的可行性已通过对人线粒体基因组完整序列的分析得到证实。利用基因芯片探针杂交方法可以对2个以上不同的耐药性基因同时进行分析，如结核分枝杆菌对INH、RFP、EMB、PZA等多种药物的耐药基因都可同时进行检测。该技术具有无可比拟的高效、快速和多参量的特点，是目前分子生物学最前沿的方法，可准确地确定突变位点和突变类型，现已广泛应用于结核的菌种鉴定、耐药性检测及其基因组比较分析等研究领域［10]。

7.变性梯度凝胶电泳（DGGE）：其原理是双链DNA在递增的变性剂浓度梯度或温度梯度中电泳时，DNA不同区段可根据不同的溶解温度（Tm）而解离。杂交体中碱基的错配会造成相应区段的不稳定，致使同源体和杂交体之间相应区段的Tm差异可达6℃，野生型和突变型单链所形成的杂交体即可被区分出来。值得注意的是，DGGE在分析每一特定的PCR片段之前，需要通过预试验来确定其最佳的电泳条件，以获得最大的分离度。这需要一定的电泳条件，实验室可自行操作。

8.荧光定量PCR：PCR是对原始待测模板核酸的一个扩增过程，任何干扰PCR指数扩增的因素都会影响扩增产物的量，使得PCR扩增终产物的数量与原始模板数量之间没有一个固定的比例关系，通过检测扩增终产物很难对原始模板进行准确定量。近年来研究人员通过大量的实践，研究了相对准确的定量PCR方法，即荧光定量PCR，目前荧光定量PCR均采用外标定量。其主要原理：荧光共振能量转移，外来光源激发供体荧光染料发出荧光，当其发射波长与受体荧光染料的吸收波长部分重叠，且两者距离很近时，受体荧光染料吸收供体荧光传递的能量而激发出另一波长的荧光，同时将供体荧光淬灭。荧光定量PCR有如下显著的优点：特异度好，灵敏度高，线性关系好、线性范围宽，操作简单、安全、自动化程度高、防污染、速度快、高通量、可在2～3h完成96个样品的定量分析［21]。

9.分子信标：为一茎环状结构的寡核苷酸探针，其环状区核苷酸序列与靶核酸互补，靠近两端的部分序列互补构成分子信标的茎部，两末端分别标记荧光基团和淬灭基团。当靶核酸存在时，茎部结构结合靶序列而打开，荧光基团和淬灭基团分开，产生荧光，荧光多少与茎部结构同靶序列结合的程度有关。

10.枝链DNA（bDNA）：是一个多重杂交系统，其检测灵敏度大大提高。将靶DNA与固相固定的特异探针杂交，再加入另一特异探针与靶DNA杂交，此探针可结合一树枝状bDNA，标记有（AP）的探针与bDNA结合，加入发光底物，用发光检测仪来测量发光强度，灵敏度高，接近PCR水平。已有人将此法用于细菌耐药性检测。

总之随着分子生物学技术的不断进步，结核分枝杆菌的检测方法有一定的进展，但应看到并不是每种药物只有一种耐药基因，临床的检测手段在实际应用中有各方面的局限性，因此应寻找每种药物全部耐药基因，以及基因与耐药之间的关系，建立快速、简便、可靠的检测方法对其耐药性进行检测，以指导临床的早期治疗和有效的控制结核病。

展 望

耐药现象大大削弱了抗结核药物的疗效。早期检测结核分枝杆菌耐药性，对控制结核病极为重要。目前用于结核分枝杆菌耐药性监测的传统方法耗时长，不能满足临床治疗的需求，因此，国内外都在寻找1种快速而且灵敏度高的监测方法，以期快速的给临床治疗提供依据。由于结核菌耐药机制复杂，常有多重耐药，其耐药性检测也应选择合适的方法，检测多个耐药基因，并结合传统的培养方法。目前DNA芯片技术发展迅速，可在同一载体上进行多个基因检测，其具有高密度、高容量的特点，可导致一个量变到质变的过程，将是非常好的耐药性检测手段。这样可以在1个芯片上检测结核分枝杆菌对几种药物的耐药性，即加快了监测速度又节约了成本。分子生物学检测技术在鉴定结核分枝杆菌耐药性方面比传统的培养法有明显的优势，但由于结核分枝杆菌的耐药性与基因突变的确切关系尚未完全阐明，加之生物学检测技术灵敏度的限制（对某些药物缺乏敏感度），基因突变型和其耐药表型的不一致，以及未发现的耐药基因的存在，使目前分子生物学检测尚不能完全取代常规培养法来鉴定结核分枝杆菌的耐药性。随着分子生物学的发展，基因芯片技术的应用前景将会更加广阔，建立简便、灵敏、特异的快速测定方法，可以及时地为临床治疗提供依据。

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