结核分枝杆菌的休眠机制研究进展

姚楠 张万江

结核病是长期危害人类健康的严重传染病之一，全球每年因肺结核死亡的患者超出300万例之多。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，现有结核病患者约500万例，仅次于印度，居世界第2位。据WHO估算全球有近1／3的人群感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb），而其中仅10%发展为活动性结核病，大多数转变为潜伏感染，此时Mtb多以休眠菌形式存在［1］。但近年来由于人口增加、流动人口增多、耐药Mtb增多、农村医疗条件差，以及个体免疫力低下等原因使活动性结核病的比率大幅度提高，故研究结核发病机制的分子基础至关重要。

Mtb的休眠状态

Mtb的休眠状态是指Mtb可以在体内形成一种持续存在的状态，在这种状态下，细菌生长极为缓慢，细菌的酶活性降低从而使细菌的代谢路径改变，同时蛋白合成改变，总蛋白的合成减少，细胞壁增厚，出现大量的16kD小热休克蛋白［2］。

McCune等［3］于20世纪50年代首先提出结核休眠菌（dormant tubercle bacilli）的概念，在其设计的Cornell模型中用大剂量Mtb毒株感染小鼠，疾病自然进展2周，然后用异烟肼（INH）和吡嗪酰胺（PZA）联合化疗12周后，取小鼠的肺和脾脏组织培养无Mtb生长。倘若不给予进一步治疗，间隔一段时间可见Mtb又重新出现在这些组织，由此McCune等认为这些组织中可能存在休眠状态的Mtb。Wayne等［4］于1994年提出结核休眠菌是残存在人体单核巨噬细胞内极微量，处于代谢静止期的Mtb。这些休眠菌可在体内持续存在数月至数年而机体没有不适或临床症状，当机体免疫力降低时结核休眠菌又开始生长繁殖，导致疾病发生，出现临床症状，这是近年来结核病发病率回升的主要因素之一。

在Wayne等［4］制作的体外“休眠”模型中，Mtb在氧气缺乏的情况下形成了一种厌氧、耐药和不能复制的状态，认为生长繁殖期Mtb向休眠期Mtb转变过程中可能存在某些酶的改变，使其代谢模式向乙醛酸旁路或其他旁路转变，从而适应休眠状态。感染机体的Mtb可能有处于休眠状态，因此休眠状态Mtb在人体内是普遍存在的。

Mtb休眠机制及相关因素

一、Mtb休眠生物学机制

随着人们对潜伏感染的认识，休眠期Mtb表达的抗原物质开始受到重视。体内潜伏感染Mtb可通过改变基因或蛋白的表达而适应不同的外部环境，从而在Mtb感染的不同阶段产生相应的不同的抗体［5］。休眠期 Mtb为了适应缺氧等恶劣生存环境，使得部分基因表达上调。Mtb还通过抑制Ca2＋依赖性Ⅲ型磷脂酰肌醇3－激酶（Phosphoinositide 3－kinase，PI3K）：hVps34p级联反应，抑制吞噬体成熟，从而利于其寄生胞内［6］。在低氧和NO作用的环境中，休眠相关DosR调节子（包括48个基因）和HspX（Q－crystallin）基因表达上调［7］，部分上调表达的因子有抗原性［8］。其中，HspX抗原可以被致敏的T细胞识别，刺激T细胞分泌γ干扰素（IFN－γ），具有细胞免疫和体液免疫原性［8］。目前比较明确的与Mtb休眠有关的抗原包括小分子热休克蛋白（small heat shock proteins，sHSPs）Hspl6.3、阿拉伯－甘露醇聚糖脂（lipoarabinomnnan，LAM）和异柠檬酸裂解酶（Isocitrate Lyase，ICL）［5］。

二、Mtb休眠与“泡沫”巨噬细胞（“foamy”macrophage）

泡沫细胞是由于多种原因导致细胞内脂质大量聚集形成的，主要来源于巨噬细胞［9］。近期有休眠模型研究表明，“泡沫”巨噬细胞的形成可能是 Mtb感染持续性的关键［10］，该模型在体外模拟人类免疫反应进行实验，发现Mtb可引导免疫细胞转型为“泡沫”细胞，转化为“泡沫”细胞的巨噬细胞会丧失杀菌能力，转型为一种非攻击型状态，且在细胞内累积大量的脂质，Mtb借此逃避宿主的免疫攻击同时获得大量的营养成分。Mtb在这些细胞可持续存活，随后进入休眠状态。

三、Mtb相关蛋白

（一）小分子热休克蛋白（Hsp16.3）

Mtb小分子热休克蛋白Hsp16.3是近年研究发现的存在于Mtb膜上的一个主要抗原蛋白，由144个氨基酸组成，相对分子质量为16.277kD，等电点为4.85，序列分析表明它属于sHsps家族［11-13］。有研究表明，Hsp16.3 可能与Mtb潜伏感染中体眠菌的形成有关［14］，该蛋白具有人和鼠的T细胞识别表位，并能诱导一定的细胞免疫应答，可能是Mtb潜伏性感染时的靶抗原［15］。

同时，Mtb进入宿主巨噬细胞时可大量表达Hsp16.3，对其在宿主巨噬细胞内长期生长、繁殖和致病性都起重要作用［11］。Cunningham等［16］用转换电镜观察到无氧条件下的Mtb休眠菌细胞壁增厚现象，同时用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）法测得休眠状态下16kD小分子热休克蛋白高度表达，并且发现该蛋白与细胞壁增厚以及纤维肽多糖结构有关，认为细胞壁增厚和16kD小分子热休克蛋白的高度表达是Mtb能以休眠状态长期存在的主要原因。当Mtb在体内进入巨噬细胞或在厌氧环境培养时，存在于细胞质膜上的主要抗原Hsp 16.3会迅速大量表达，最多可达到整个菌体蛋白的25%，Mtb细胞壁增厚，以适应长期潜伏生长的需要［16］。

另有研究表明，Hsp16.3不仅有助于 Mtb细胞膜的增厚，以及增强Mtb抵抗胁迫环境的能力，如NO、氧自由基、缺氧等不利因素的影响等，而且同时可以使Mtb在宿主巨噬细胞内的生长状态转变为静止，有助于Mtb在宿主巨噬细胞内滞留，长期生长繁殖［17］。

（二）LAM

LAM是一种非蛋白 Mtb抗原，属多糖，具有较强的免疫原性，能够刺激Mtb感染者产生抗体。有文献报道，Mtb感染宿主细胞后可引起丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen－activated protein kinase，MAPK）通路、PI3K／Akt通路和连接蛋白－信号转导子和转录激活子（just another kinase，JAK）／（signal transducer and activator of transcription，STAT）通路等多条相关信号传导通路的激活或抑制［18］。人体细胞受到Mtb刺激后，经三级激酶级联反应MAPKKK→MAPKK→MAPK，在MAPKK处激活应激活化的蛋白激酶（Stress－activated protein kinases，SAPK）／c－Jun氨基端激酶（C－Jun N－terminal kinases，JNK），p38MAPK和细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）3 条 不 同 的MAPK支路［19］。有研究表明LAM可促进SAPK去磷酸化及ERK酪氨酸磷酸化过程，抑制神经酰胺（ceramide）的产生，有抗凋亡作用，使宿主细胞能够在感染状态下继续存活，抵抗巨噬细胞的杀灭作用［18，20］。其机制可能为：（1）清除具有细胞毒性的氧自由基；（2）抑制蛋白激酶C的活性；（3）阻断IFN－γ诱导的人巨噬细胞样细胞系的基因转录；（4）诱导TNF－α的生成［21］。其中，TNF－α是参与炎症诱导和肉芽肿形成等宿主早期免疫反应的主要免疫因子之一，但Roach等［22］发现无毒株 H37Ra的LAM 可诱导巨噬细胞合成TNF－α，而有毒株Erdman的LAM不能诱导巨噬细胞合成TNF－α，从而认为LAM是有毒株Mtb能在巨噬细胞内持续存在的原因之一。

（三）ICL

ICL为Mtb乙醛酸循环途径的关键酶之一，催化异柠檬酸裂解为琥铂酸和乙醛酸。处于潜伏感染状态下的Mtb主要通过乙醛酸循环途径代谢脂肪酸维持生存。李俊明等［23］研究认为异柠檬酸裂解酶通过抑制宿主细胞的凋亡可能是增强胞内存活的相关重要机制之一。ICL以前被证实在Mtb的细胞内新陈代谢中扮演着关键的角色，当Mtb处于潜伏状态或被巨噬细胞吞噬后，其ICL的表达水平显著升高［24］。

四、Mtb休眠的基因基础

有研究表明大多数活动性结核是潜伏感染的Mtb重新被激活所致［25］。休眠状态Mtb复苏基因的启动是休眠Mtb复苏的关键，阻断复苏基因启动，让休眠Mtb永远“沉睡”是防止结核病复燃的关键环节。

目前研究发现，与Mtb休眠相关的基因有二碳代谢基因、核糖蛋白合成下调基因及胶原基质合成基因等［26］。也有研究表明，维生素D的代谢产物可活化巨噬细胞，抑制Mtb活性，且维生素D受体（VDR）基因可通过调节巨噬细胞的吞噬作用和杀菌活性，影响Mtb在胞内的存活状态，可能会对肺结核复发有一定影响［27］。

1996年DeMaio等［28］用PCR法从 Mtb中克隆出一种Sigma因子基因（SigF），其编码的蛋白与蓝链丝菌和枯草杆菌的芽孢形成因子（SigF）及枯草杆菌的应激反应因子（SigB）相似，其mRNA在牛结核分枝杆菌培养的稳定期、氮耗竭期、冷休克时可大量表达，但在对数期不表达，在对数期后、氧化应激时、无氧和酒精性休克时少量表达。因此有学者认为，SigF基因的高表达在Mtb适应休眠状态和抵抗宿主防御反应中有一定的作用［29］。devR基因和ATP合成下调基因也是维持Mtb休眠状态的必需基因［30］。如果将这些休眠维持基因作为分子靶位，改变其表达方式或是结果，从而改变休眠菌的生存条件，将是防止结核病复燃的有效途径。

休眠菌复苏机制及相关因子

潜伏的休眠菌如何终止休眠也是目前主要的研究领域之一。复活促进因子（Rpf）是休眠菌终止休眠的重要因素之一，最早在藤黄微球菌（Micrococcus luteus）中发现，是一种抗休眠因子，可以促进休眠期 Mtb的生长［31］。Biketov等［32］研究巨噬细胞内Mtb的分离培养时则发现，巨噬细胞内Mtb由于菌体受到损伤或处于休眠状态，其在体外生长困难，所测的单位体积内细菌形成单位（CFU）明显低于实际细菌浓度，当加入Rpf后可促进受损伤菌体或处于休眠状态菌体的复苏和生长，生长数量明显增加，敏感度增高。

Mtb中存在5种功能部分重叠的Rpf样蛋白，即RpfA、RpfB、RpfC、RpfD和 RpfE。Kana等［33］证明在 Mtb生长中5种基因都是非必需的，遗传互补或加入野生型Mtb培养基滤液可以使休眠菌恢复正常生长，并且还发现RpfB和RpfE在功能上比RpfD更重要。Hett等［34］利用酵母双杂交鉴定了一种能够与RpfB结合的伴侣蛋白分子，它是一种Mtb内肽酶，称作Rpf相互作用蛋白A（RipA）。它们之间的相互作用是通过体内和体外的共沉淀实验确定的，相互作用的结构域在2个蛋白的C端，靠近溶菌酶结构域。RipA是一种与细胞膜结合的分泌蛋白，也是一种肽聚糖水解酶，能够水解细胞壁，与RpfB在同一个细胞腔隙中，荧光显微检测表明两者都定位在活动性Mtb的隔膜上。2种肽聚糖水解酶之间的相互作用，暗示它们的复合物在细胞分裂中起作用，也可能在休眠菌复活中起作用。

结 语

目前我国的结核病现状仍不容乐观，需对结核病的发病机制进行更深入的研究。而目前认为休眠Mtb是导致结核菌潜伏感染的重要因素之一，休眠Mtb复苏基因的启动是影响其复苏的关键，这一机制的启动将涉及多条复杂的细胞信号通路及若干复苏基因，若能寻求一种途径阻止细胞信号通路的传导或干扰复苏基因的表达，让休眠Mtb永远沉睡，将对降低结核病的复发率，继而从根本上消除结核病具有重要意义。而如何阻断其进入休眠状态和杀灭结核休眠菌仍需进一步研究。

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