阿托伐他汀对小鼠病毒性心肌炎心肌细胞凋亡的影响研究*

关键，孙妍，孙筱璐，梁岩，王国干

阿托伐他汀对小鼠病毒性心肌炎心肌细胞凋亡的影响研究*

关键＊＊，孙妍，孙筱璐，梁岩，王国干

目的:阿托伐他汀钙(atorvastatin)对减少小鼠病毒性心肌炎(VMC)心肌细胞凋亡的影响。

方法:4周龄小鼠146只按随机数字法分为4组:正常对照组(正常组，n=18);病毒性心肌炎组(VMC组，n=60);阿托伐他汀钙药物对照组(对照组，n=18);阿托伐他汀钙治疗病毒性心肌炎组(VMC药物治疗组，n=50)。VMC组及VMC药物治疗组小鼠腹腔接种柯萨奇病毒，正常组及对照组未注射病毒，VMC组及VMC药物治疗组小鼠给予阿托伐他汀钙，连续用药2周。用药后3、7、10、14、21、30天，苏木素-伊红染色观察心肌组织炎症浸润程度，电镜观察心肌胶原纤维及各种细胞器的变化。缺口末端标记法(TUNEL)检测心肌细胞凋亡情况。反转录酶-聚合酶连锁反应(RT-PCR)及蛋白质印迹方法检测心肌脂肪酸合成酶(Fas)信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表达水平。

结果:VMC组比VMC药物治疗组的30天累计生存率低，差异有统计学意义(P=0.008)。VMC药物冶疗组比VMC组在第10、14、21、30天的心肌病理组织学积分均减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。VMC药物治疗组比VMC组心肌损伤的病灶数量少，心肌线粒体和肌浆网改变也较同期VMC组轻。第14、21天VMC药物治疗组比VMC组凋亡指数降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。VMC组比正常组FasmRNA和蛋白的表达均增加，VMC药物治疗组比VMC组Fas mRNA和蛋白的表达均减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。

结论:阿托伐他汀钙改善VMC小鼠生存率，改善组织病理学表现，其机制可能与通过下调Fas转录及表达，从而抑制心肌细胞凋亡有关。表明阿托伐他汀钙对VMC小鼠有明显的保护作用。关键词 病毒性心肌炎;阿托伐他汀钙;凋亡;心肌脂肪酸合成酶*基金项目:国家博士点基金资助(2006-GB05)

(Chinese Circulation Journal，2011，26:220.)

病毒性心肌炎(VMC)发病率呈逐年增高趋势［1］，柯萨奇病毒 B3(CVB3)是 VMC的重要病原体［2］。VMC的发病机制与病毒对心肌的直接损伤和免疫反应对心肌的损伤有关［3］。已证实病毒感染心肌细胞时可同时启动细胞凋亡途径，在VMC的发病中起重要作用［4］。脂肪酸合成酶(Fas)是一种跨膜蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，它与脂肪酸合成酶配体(FasL)结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡［5］。他汀类药物是临床应用的降脂药物［6］，还具有独立于降脂效应以外的免疫调节和影响细胞凋亡的作用［7］。本文探讨阿托伐他汀钙(atorvastatin)对减少小鼠病毒性心肌炎(VMC)心肌细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

分组及标本采集制备:本研究2007-09至2009-05，取4周龄健康雄性近交系纯种 Balb/c小鼠146只，体重约10～11 g。小鼠按随机数字法分为4组:正常对照组(正常组，n=18)，病毒性心肌炎组(VMC组，n=60)，阿托伐他汀钙药物对照组(对照组，n=18)，阿托伐他汀钙治疗病毒性心肌炎组(VMC药物治疗组，n=50)。VMC 小鼠模型的建立［8］:腹腔接种0.3 ml M株CVB3病毒，浓度为3×103PFU/mL。正常组及对照组腹腔无菌注射不含病毒的培养液。注射当天为第0天，对照组及VMC药物治疗组从第3天给予阿托伐他汀钙10 mg/(kg·d)，VMC组给予等体积饮用水，以灌胃器给药，连续用药 2 周。在第 3、7、10、14、21、30天各组小鼠取血后处死并留取心脏。将血离心取血清-80℃冰箱保存;将心脏一半用4%多聚甲醛固定3天做伊红染色、免疫组化等检查，心脏另一半用液氮冻存待做逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)等检查。各组随机取两只小鼠心肌标本2～3 mm3用3%戊二醛固定送电镜检查。

一般观察:观察动物的进食进水量，粪便情况，活动力，观察毛发以及神经系统、循环系统、呼吸系统等情况。记录死亡情况。

光镜观察:小鼠心脏4%多聚甲醛固定3天后，常规制片苏木素-伊红染色，观察组织切片心肌细胞损伤、炎性细胞浸润或组织损伤的程度，参照Rezkalla方法计算心肌病理组织学积分:每张切片取5个高倍视野，计算每个视野中炎性细胞浸润及坏死区域与整个视野面积之比:无病变计0分，病变面积＜25%计1分，26～50%计2分，51～75%计3分，＞76%计4分［9］。

电镜观察:小鼠心脏标本用3%戊二醛固定后，常规制样。观察心肌胶原纤维、心肌细胞及各种细胞器和细胞间隙的变化。

脱氧核糖核酸(RNA)缺口末端标记法(TUNEL)检测小鼠心肌细胞凋亡情况:根据缺口末端标记法试剂盒(罗氏公司 美国)的说明书进行操作，检测各组小鼠的心肌细胞凋亡情况，计算并比较心肌细胞凋亡指数。每张切片于200倍光镜下，随机选择5个无重复的亮视野，计数呈深褐色的TUNEL阳性细胞核以及所有细胞核。细胞凋亡指数=平均阳性染色细胞核数/所有细胞核数×100。

反转录酶-聚合酶连锁反应检测心肌组织信使核糖核酸(mRNA)表达:提取心肌标本的总核糖核酸，用第一链脱氧核糖核酸(cDNA)合成试剂盒(MBI公司，美国)合成 cDNA。Fas的引物意义链为:5-GCACAGAAGGGAAGGAGTAC-3，反意义链为:5-CTCTTCAGCAATTCTCGGGA-3。产物长度452 bp。β肌动蛋白(β-actin)引物意义链为:5-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3，反 意 义 链 为:5-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3。产物是353 bp(上海生工生物工程公司 中国)。PCR的反应条件为:94℃ 3 min预变性，随后 94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，扩增 22 个循环，72℃延伸10 min。产物于1.5%含溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳，紫外检测仪观察照相，以β肌动蛋白为内参计算相对灰度。

蛋白质印迹检测心肌组织中Fas蛋白的表达:具体步骤如下，提取组织蛋白，配置5%的浓缩胶及12%的分离胶，取24μg总蛋白加入6μl 5×凝胶上样缓冲液，煮沸5 min后加入凝胶加样孔，以100 V电压进行电泳2 h。电泳结束后取出凝胶，应用湿式转移电泳槽在200 mA稳流条件下进行电转移2 h。电转移完成后将聚偏氟乙烯(PVDF)膜置于封闭液中1 h。加入Fas抗体(Santa Cruz，美国)4℃孵育过夜，洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37℃孵育1 h，洗涤后应用化学发光试剂盒进行化学增强发光及X胶片显色。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)做内参。采用 Image-ProPlus软件(Version 4.1，Media Cybernetics，LP，USA)分析照片中蛋白条带的灰度。

统计学方法:各参数以均数±标准差表示，计数资料组间比较采用方差分析或非配对t检验，分级资料用非参数统计Two-Sample Kolmogorov-Smirnov Test方法。生存曲线由Kaplan-Meier法完成，post-hoc检验用于比较各组生存率间的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。SPSS 11.0统计软件协助处理数据。

2 结果

一般观察及生存率:正常组与对照组小鼠一般情况好。VMC组小鼠腹腔注射病毒后第3天开始出现耸毛，拱背，懒动，饮水进食减少，体重减轻;第4天出现死亡;第7～14天为死亡高峰。VMC药物治疗组也有上述症状出现，但表现较轻。VMC组比VMC药物治疗组的30天累计生存率低(59.2%vs 87.0%)，差异有统计学意义(P=0.008)。各组小鼠30天累计生存率分析见图1。

图1 阿托伐他汀对各组小鼠30天累计生存率的影响。病毒性心肌炎组与阿托伐他汀钙治疗病毒性心肌炎组比较P=0.008。

光镜观察:病毒性心肌炎小鼠尸检见心外膜表面有大面积白色渗出物。心肌组织检测正常组与对照组均未见病理性改变。VMC组:小鼠感染CVB3后，第3天心肌未见显著改变，第7天心肌细胞出现混浊肿胀，结构不清，胞浆染色嗜酸性增强，可见少许炎性细胞浸润，第10天出现炎性细胞灶性浸润，心肌呈透明样变性，胞核碎裂或者消失，间质水肿，第14天，大量炎性细胞浸润，广泛心肌坏死，坏死灶周围可见钙化灶，第21天，心肌细胞坏死，肌纤维溶解吸收，可见坏死后空架，第30天，坏死灶形成瘢痕。VMC药物冶疗组比VMC组心肌病理组织学积分在第10天(0.56 vs 1.72)，14天(1.16 vs 2.12)，21 天(0.64 vs 1.6)，30 天(0.12 vs 0.92)均减少，差异均有统计学意义(P＜0.05)。

电镜观察:VMC组的非炎症灶内的心肌细胞肌浆网明显扩张，线粒体肿胀、嵴断裂溶解，线粒体有空泡化，并有髓鞘样结构形成，部分心肌细胞核固缩，肌原纤维溶解消失，线粒体钙化，细胞崩解，多数囊泡形成。有灶性心肌坏死，代以单核和淋巴细胞浸润。VMC药物治疗组比VMC组心肌损伤的病灶数量少，心肌线粒体和肌浆网改变也较同期VMC组轻。

脱氧核糖核酸(RNA)缺口末端标记法检测小鼠心肌细胞凋亡:凋亡细胞的细胞核有深褐色的染色。正常组和对照组心肌细胞的凋亡指数为0。VMC组和VMC药物治疗组的小鼠心肌中可见调亡细胞，第14、21天VMC药物治疗组比VMC组凋亡指数降低(3.62 vs 12.36;1.37 vs.4.33，n=5)，差异有统计学意义(P＜0.05)。

脂肪酸合成酶表达的检测:第14天反转录酶-聚合酶连锁反应检测心肌组织Fas信使核糖核酸表达，VMC组比正常组FasmRNA的表达显著增加［(1.04±0.18)vs(0.6±0.1)］;VMC药物治疗组比VMC组Fas mRNA的表达显著减少［(0.80±0.18)vs(1.04±0.18)］，差异有统计学意义(P＜0.05，图2)。

蛋白质印迹检测心肌组织中Fas蛋白表达:第14天VMC组比正常组Fas蛋白的表达显著增加［(0.31±0.09)vs(0.20±0.07)］;VMC药物治疗组比 VMC组Fas蛋白表达减少［(0.23±0.08)vs(0.31±0.09)］差异有统计学意义(P＜0.05，图3)。

图2 阿托伐他汀对各组小鼠FasmRNA表达的影响 图3 阿托伐他汀对各组小鼠Fas蛋白表达的影响 与正常对照组比较*P＜0.01;与病毒性心肌炎组比较△P＜0.05;与病毒性心肌炎组比较▲P＜0.01 Fas:脂肪酸合成酶 mRNA:信使核糖核酸 β-actin:β-肌动蛋白 GAPDH:甘油醛-3-磷酸脱氢酶 1:正常对照组 2:病毒性心肌炎组 3:阿托伐他汀钙药物对照组 4:阿托伐他汀钙治疗病毒性心肌炎组

3 讨论

他汀类药物是有效而安全的降脂药物。近来逐渐认识到它除具有降脂作用外，还有调节免疫与抑制细胞凋亡的作用。既往研究表明他汀药物可以纠正VMC中辅助性T淋巴细胞亚群分化的不平衡，抑制主要组织相容性抗原Ⅱ的表达，抑制VMC过度的炎症和免疫反应［10］。

在感染性急性心肌炎中，直接病毒介导的损伤和病毒感染细胞的免疫介导损伤都能促成心肌损害。细胞毒T淋巴细胞(CTL)是一种特异T细胞，专门分泌各种细胞因子参与免疫作用。它介导的细胞毒性作用是VMC心肌细胞损伤的主要原因。Fas途径是T淋巴细胞致靶细胞凋亡的主要途径之一。当激活的细胞毒T淋巴细胞经Fas/FasL与靶细胞结合时，便可将凋亡信号转入后者，使靶细胞发生凋亡。有研究报道在心肌炎患者的心肌标本中存在较多的凋亡心肌细胞，提示凋亡可能是心肌炎心肌损害的机制之一;而且还发现阻断凋亡信号转导途径可有效治疗心肌炎。一些凋亡调节蛋白，如:B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)，Bcl-xL已证实参与了CVB的复制，诱导并激活了凋亡程序，参与 VMC 的病理变化［11，12］，本研究得到相似的结果。

本研究表明病毒性心肌炎模型制作成功，阿托伐他汀可以抑制柯萨奇病毒诱导的小鼠VMC的进展，改善VMC症状，减轻VMC的心肌损伤，降低小鼠死亡率。为进一步探寻阿托伐他汀钙对VMC保护作用的可能机制，本研究用缺口末端标记法、反转录酶-聚合酶连锁反应、蛋白质印迹等方法观察，见非炎症灶内的心肌有凋亡增多，而阿托伐他汀钙对它有抑制作用，同时研究也观察到小鼠心肌细胞凋亡和心肌组织中Fas表达水平相应变化，表明阿托伐他汀钙对VMC小鼠心肌中Fas系统有影响。蛋白质印迹和逆转录聚合酶链反应的结果亦分别提示VMC组心肌组织中Fas表达水平显著上调。同时也证实了VMC小鼠心肌组织中存在Fas介导的细胞凋亡。VMC药物治疗组心肌细胞凋亡减少，30天时与VMC组比较，细胞凋亡显著减少。Fas表达水平在阿托伐他汀钙组较VMC组也减低。说明阿托伐他汀可抑制细胞凋亡，其作用机制可能与其抑制Fas表达有关。这可能是治疗VMC的新途径。至于治疗组心肌组织炎症浸润较VMC组减轻的原因难以完全用心肌细胞的凋亡来解释，其原因有待进一步探索。

总之，本研究的结果提示阿托伐他汀减少病毒诱导的VMC心肌损害的严重程度，可以抑制模型动物心肌细胞凋亡和Fas的表达。阿托伐他汀对于VMC小鼠的治疗获益有可能和抑制Fas表达和细胞凋亡有关。

［1］ Feldman AM，McNamara D.Myocarditis.N Engl JMed，2000，343:1388-1398.

［2］ Crocker SJ，Frausto RF，Whitmire JK，et.al.Amelioration of coxsackievirus B3-mediated myocarditis by inhibition of tissue inhibitors of matrixmetalloproteinase-1.Am JPathol，2007，171:1762-1773.

［3］ Klingel K，Hohenadl C，Canu A，et al.Ongoing enterovirus-induced myocarditis is associated with persistent heartmuscle infection:quantitative analysis of virus replication，tissue damage，and inflammation.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89:314-318.

［4］ Seko Y，Kayagaki N，Seino K，et al.Role of Fas/FasL pathway in the activation of infiltrating cells in murine acute myocarditis caused by Coxsackievirus B3.JAm Coll Cardiol，2002，39:1399-1403.

［5］ Park DR，Thomsen AR，Frevert CW，et al.Fas(CD95)induces proinflammatory cytokine responses by humanmonocytes andmonocyte-derived macrophages.J Immunol，2003，170:6209-6216.

［6］ Grundy SM.HMG-CoA reductase inhibitors for treatmentof hypercholesterolemia.N Engl JMed，1988，319:24-33.

［7］ Jasinska M，Owczarek J，Orszulak-Michalak D.Statins:a new insight into their mechanisms of action and consequent pleiotropic effects.Pharmacol Rep.2007，59:483-499.

［8］ Mikami S，Kawashima S，Kanazawa K，et al.Expression of nitric oxide synthase in amurine model of viralmyocarditis induced by coxsackievirus B3.Biochem Biophys Res Commun.1996，27;220(3):983-989.

［9］ Rezkalla S，Kloner RA，Khatib G，et al.Beneficial effects of captopril in acute coxsackievirus B3 murine myocarditis.Circulation，1990，81(3):1039-1040.

［10］ López P，Gutiérrez C，Suárez A.IFNalpha treatment generates antigenpresenting cells insensitive to atorvastatin inhibition of MHC-II expression.Clin Immunol.2008，129(2):350-359.

［11］ Feuer R，Mena I，Pagarigan RR，et al.Coxsackievirus B3 and the neonatal CNS:the roles of stem cells，developing neurons，and apoptosis in infection，viral dissemination，and disease.Am J Pathol，2003，163:1379-1393.

［12］ Martin U，Nestler M，Munder T，et al.Characterization of coxsackievirus B3-caused apoptosis under in vitro conditions.Med Microbiol Immunol，2004，193:133-139.

(助理编辑:曹洪红)

Atorvastatin Inhibits Cardiom yocyte Apoptosis in Viral Myocarditis M ice

GUAN Jian＊＊＊，SUN Yan，SUN Xiao-lu，LIANG Yan，WANG Guo-Gan.
Department of Emergency，Cardiovascular Institute and Fu Wai Hospital，CAMS and PUMC，Beijing(100037)，China Corresponding Author:WANG Guo-Gan，Email:wangguog@263.net

Objective:To investigate the inhibition effect of atorvastatin on cardiomyocyte apoptosis in viralmyocarditis(VMC)mice.

Methods:The VMCmodelwas induced by Coxsakie virus B3 injection，and themice were divided into four groups.Normal control group，n=18，VMC group，n=60，Atorvastatin control group，n=18，in which themice were treated with Atorvastatin，and VMC+Atorvastatin group，n=50.The animals received Atorvastatin 3 days after virus injection and the medication lasted for 2 weeks.3，7，10，14，21，and 30 days after themedication，themyocardial inflammation was examined by histochemistry staining，the cardiomyocyte apoptosis was determined by TdT-mediated Dutp nick end labeling(TUNEL)method，fatty acid synthase(FAS)mRNA and protein expression were detected by RT-PCR and western blot analysis respectively.

Results:Compared with VMC group，the 30 days survival rate was higher in VMC+Atorvastatin group，it also presented the improved the pathological features at10，14，21 and 30 days after themedication，TUNEL indicated that the cardiomyocyte apoptosis wasmuch lower in VMC+Atorvastatin group at14 and 21 days after themedication，P＜0.05 respectively.RT-PCR and western blot analysis revealed that the FASmRNA and protein expression were both increased in VMC group than that in Normal control group，were both decreased in VMC+Atorvastatin group than that in VMC group，P＜0.05 respectively.

Conclusion:Atorvastatin improves the survival rate and the pathological features in VMCmice，whichmightbe because of the down regulation of Fas expression and therefore，inhibit the cardiomyocyte apoptosis.

Viralmyocarditis;Atorvastatin;Apoptosis;Fatty acid synthase

100037 北京市，中国医学科学院 北京协和医学院 心血管病研究所 阜外心血管病医院 心内科(关键、孙筱璐、梁岩、王国干);北京煤炭总医院 心脏中心(孙妍)

关键 主治医师 博士 研究方向为心力衰竭 Email:gj7346@sina.com 通讯作者:王国干 Email:wangguog@263.net＊＊现工作于清华大学第一附属医院重症医学科＊＊＊Now working at the First Affiliated Hospital of Tsinghua University

R541

A

1000-3614(2011)03-0220-04

10.3969/j.issn.1000-3614.2011.03.017

2011-01-17)

·临床研究·