规模化猪场猪链球菌的分离与鉴定

胡一飞 金俊杰 郑润俊 金大春

（1浙江省瑞安市畜牧兽医局，浙江省瑞安市 325200；2温州市畜牧兽医局，浙江省温州市 325000；3瑞安市畜牧兽医局市区动物防疫所，浙江省瑞安市 325200）

规模化猪场猪链球菌的分离与鉴定

胡一飞1金俊杰2郑润俊3金大春2

（1浙江省瑞安市畜牧兽医局，浙江省瑞安市 325200；2温州市畜牧兽医局，浙江省温州市 325000；3瑞安市畜牧兽医局市区动物防疫所，浙江省瑞安市 325200）

猪链球菌病是由多种不同群、不同血清型的链球菌引起的不同临床症状的传染病的总称。因该致病菌有多达11个血清群致病，有限几个血清群 （型）的疫苗，对此病的预防根本无济于事。加上该病的耐药性强，耐药谱广，抗生素治疗经常无效。当暴发此病时，常常无计可施，且其特征性症状主要以高热和败血症为主，给人以高热病的假象。一些专家认为链球菌对当前养猪业的危害已经相当严重，并且很可能是近几年愈演愈烈的无名高热综合征的主要病原[1]。本试验通过对瑞安市规模化猪场进行猪链球菌的分离、鉴定及药敏试验，为预防和控制该病的流行提供了重要依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1病料来源

病料取自2007年9月至2010年5月在本市发生猪高热病的7家畜牧场的发病猪。

1.1.2 细菌分离培养基

普通琼脂培养基、麦康凯培养基、血平板培养基、普通液体培养基。

1.1.3 试验用品

细菌鉴定用的微量生化管、药敏纸片、革兰氏染色液、无菌绵羊血购自杭州天和微生物有限公司；试验用的化学试剂购自化工市场，均为国产分析纯。

1.1.4 实验小鼠和试验兔

实验用的小鼠和兔子购自温州医学院实验动物中心，均为清洁级。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离纯化

用接种针无菌取病猪心血、肝、肺组织分别接种到绵羊全血平板和普通固体培养基，37℃培养，从平板上挑取单菌落再次进行纯培养。

1.2.2细菌鉴定

对需进一步鉴定的纯培养细菌进行涂片染色镜检，观察其形态、大小及染色特性，移植于绵羊全血平板和普通固体培养基，进行生长观察，并进行生化鉴定。

1.2.3生化试验

用微量生化试验管，按说明书操作进行生化试验[2]。

1.2.4药敏试验

将分离鉴定好的菌株接种于绵羊全血平板，涂匀，选取相应抗生素的药敏纸片贴于培养基上。于37℃培养箱培养过夜，测量抑菌环直径并判定结果。

1.2.5动物试验

用分离的链球菌过夜培养液分别接种兔子 （耳静脉注射1.5 mL+皮下分四点注射，每点0.5 mL），观察其表现并测量体温，记录并连续观察7天；用分离的链球菌过夜培养物分别接种小白鼠，每只0.2 mL腹腔注射，观察其表现情况和死亡情况，记录并连续观察7天。

2 结果

2.1 细菌分离结果

对多个规模猪场送检的病死猪样品进行细菌学化验，基本上每个发病猪场都分离到细菌，某些猪场首次送检样品时由于采样前大剂量使用过抗生素而未分离到细菌，经重新采样，从流产、死产胎儿、新生仔猪或未使用过抗生素的患病个体采集，均成功分离出致病菌。

2.2 细菌培养结果

对13株分离菌进行鲜血琼脂平板培养，37℃培养24小时后，共有10个菌株在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、灰白色、针尖大小、圆形、半透明、隆起的小菌落，并呈现草绿色溶血。单个菌落涂片染色后经革兰氏染色，普通光学显微镜下镜检，可见革兰氏染色阳性、呈长链状的球菌。其余3株菌落形态、溶血特征及单个菌落涂片染色镜检等不符合以上特征 （2株能在麦康凯平板生长的，一株为大肠杆菌、一株为沙门氏菌，另外一株镜检为葡萄球菌）。具体见表1。

2.3生化鉴定结果

对上述10株分离纯化后的细菌进行生化鉴定，10株均符合猪链球菌的生化培养特性 （见表2），说明分离10株细菌为猪链球菌。

2.4 药敏试验结果

从药物敏感试验结果看，对大部分猪链球菌高度敏感的药物有头孢噻呋、头孢噻肟等新药；环丙沙星、先锋V、头孢拉定、新霉素、阿莫西林、氟苯尼考等为中敏药物；林可霉素、壮观霉素、强力霉素、复方新诺明、丁胺卡那等为低敏药物，而牧场中最常用的青霉素G、链霉素、庆大霉素、四环素、卡那霉素、红霉素、痢特灵等对大部分猪链球菌无效。

2.5 动物试验结果

2.5.1兔子攻毒结果

用分离链球菌过夜培养液 （耳静脉1.5 mL注射+皮下分四点注射，每点0.5 mL）接种10只兔子，接种后2小时内体温逐渐上升，并超过1℃以上，维持2小时左右，以后一直缓慢下降，均于24小时内死亡。其中呼吸症状逐渐明显，耳静脉充血明显。对死亡的兔子剖检，病理变化几乎相似，表现为：肺水肿，肺上有出血斑，肝肿大、肾有出血点，病料中均可分离到链球菌。

2.5.2小白鼠攻毒结果

链球菌过夜培养液接种小白鼠进行攻毒实验，接种20只小鼠，每只小鼠腹腔注射培养物0.2 mL过夜，4小时后，扎堆、嗜睡较严重，并出现弓背、对外界反应迟钝、呼吸急促、食欲减退、饮欲增加，24个小时内，有10只死亡，两只濒临死亡。48小时全部死亡。对死亡的小白鼠剖检，病理变化几乎相似，表现为：肺水肿，肺上有出血，肝肿大。从死亡小鼠均可分离到链球菌。

3 讨论

本次试验从7家猪场分离到的13株细菌中，其中10株猪链球菌、1株葡萄球菌，1株沙门氏菌，1株大肠杆菌；说明链球菌是这些猪场细菌性疾病的主要病原之一。

通过本次的药敏试验可以看出，目前一般使用较少的头孢类抗生素对猪链球菌病的控制和预防有一定的效果，而目前猪场经常使用的药物效果较差。因此建议猪场尽量根据本场情况，选择合适药物进行治疗和预防。同时尽量轮换使用药物，对低敏感的药物直接停用半年以上。

经过动物试验明显可以看出，此次分离的链球菌致病性较强，可以引起试验动物发生持续高温，并造成肺、肝、肾等多脏器出血、衰竭，这不仅是导致发生猪高热病以后，出现高热不退，多器官衰竭的主要原因，而且链球菌对林可霉素、壮观霉素、强力霉素、复方新诺明、丁胺卡那等药物具有很强的耐药性，导致开始运用抗生素治疗效果差。

[1]冷和平， 曾俊霞， 温育铭， 李奎.七个猪场猪圆环病毒2型感染并发副猪嗜血杆菌病和链球菌病的综合防治.猪业科学，2008（10）：80-83.

[2]姚火春.兽医微生物学实验指导 （第二版）.北京： 中国农业出版杜，2002.114-118.