P38信号通路对大鼠神经干细胞增殖的影响

佟雷，王振宇，季丽莉，佟晓杰

（中国医科大学基础医学院 解剖学教研室，沈阳 110001）

P38信号通路对大鼠神经干细胞增殖的影响

佟雷，王振宇，季丽莉，佟晓杰

（中国医科大学基础医学院 解剖学教研室，沈阳 110001）

目的探讨P38信号转导通路对大鼠海马神经干细胞增殖的影响。方法 体外培养大鼠海马神经干细胞，将培养细胞分为2组，对照组采用神经干细胞培养液进行培养，实验组中在神经干细胞培养液的基础上添加P38通路抑制剂SB203580，Western blot方法检测细胞中P38及磷酸化P38的表达情况，MTT法检测其对神经干细胞增殖的影响。结果 神经干细胞加入SB203580后P38磷酸化水平明显低于对照组，实验组可见干细胞球逐渐增大，MTT法测定结果显示细胞增殖速度与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论P38信号转导通路被抑制后，神经干细胞的增殖能力明显增强。

神经干细胞；增殖；P38信号转导通路；新生大鼠

神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是中枢神经系统内具有多向分化能力的干细胞，可分化为神经元、胶质细胞等［1］。目前被广泛应用于细胞移植和基因治疗载体的研究［2］。神经干细胞的移植为脑组织损伤的修复治疗提供了有效的手段，其增殖受多种因素的调节。P38信号转导通路是MAPK信号转导通路的一种，是1993年由Brewster等［3］人在研究高渗环境对真菌的影响时发现的。目前已发现 P38有 5个异构体，分别为 P38α、P38β1、P38β2、P38γ、P38δ［4］。在神经干细胞增殖的过程中是否激活了P38通路目前尚不清楚。本实验向神经干细胞培养液中添加P38通路抑制剂SB203580，检测神经干细胞的增殖情况，探讨P38通路在神经干细胞增殖中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及药品

Wistar大鼠，生后3d，由中国医科大学实验动物部提供。DMEM/F12（1∶1）培养液、B27添加剂购于Gibco公司，碱性成纤维生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）购于R&D公司，巢蛋白（Nestin）抗体购于武汉中美公司，FITC、TRITC标记山羊抗兔IgG、hoechst 33342购于中杉金桥公司，D-Hanks液自备，SB 203580购自上海碧云天公司，P38、p-P38抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 实验动物分组

将培养细胞分为对照组和实验组，对照组采用神经干细胞培养液进行培养，实验组采用在神经干细胞培养液的基础上添加P38通路抑制剂SB203580。

1.3 NSCs的培养及染色

细胞培养：根据我们以前报道的方法进行神经干细胞的培养［5］。分离大鼠双侧海马组织放入DHanks液中，剪碎，胰蛋白酶消化，离心5min，以1×106/mL密度接种于50mL培养瓶中，37℃、5%CO2孵箱中静置培养。每隔24～48h半量换液1次。待大多数克隆球直径为200μm时进行传代，以5×105/mL密度接种于50mL培养瓶中，37℃、5%CO2孵箱中静置培养，每隔24～48h半量换液1次，每隔7d左右传代1次。

免疫荧光染色：将克隆球放置在涂有布多聚赖氨酸的孔板中生长4h后，40g/L多聚甲醛固定，进行Nestin免疫荧光染色。

1.4 P38通路抑制剂SB203580对NSCs增殖的影响

将神经干细胞分为对照组和实验组，对照组培养液采用DMEM/F12+2%B27+EGF（20ng/mL）+bFGF（20ng/mL）+青/链霉素（100U/mL）+两性霉素B（250ng/mL），实验组培养液在对照组基础上添加10μmol/L的P38通路抑制剂SB203580。每天相差显微镜下观察，并用MTT法检测神经干细胞增殖情况。

1.5 Western blot检测P38和p-P38蛋白表达

加入抑制剂后，Western blot检测对照组和实验组神经干细胞中P38总蛋白和磷酸化蛋白的表达。

1.6 MTT法检测神经干细胞增殖情况

收集对数期细胞，调节悬液浓度1×106/mL，将等量细胞悬液100μL加入到96孔细胞培养板中，各组重复5孔。置于37℃，5%CO2孵育16～48h，每孔加入10μL MTT溶液，继续培养4h后，1000r/min离心10min，去掉上清，每孔加入100μL DMSO，水平振荡10min后在酶标仪波长570nm处测吸光值。

2 结果

2.1 神经干细胞培养及免疫荧光染色结果

原代培养3d，能观察到细胞分裂现象；培养7d可见悬浮生长的直径约为100μm左右的克隆球；培养10d左右多数克隆球直径达到200μm；传代培养细胞增殖较原代培养时快，在传代培养7d时能形成直径约200μm的克隆球。

免疫荧光染色结果显示：克隆球呈Nestin阳性（图1），红色部分为Nestin阳性细胞（图1A），蓝色部分为细胞核（图1B），表明培养的细胞表达神经干细胞特异性标记Nestin。

2.2 应用抑制剂后磷酸化及总P38的表达情况

加入抑制剂后，与加入前（0h）相比，P38的磷酸化水平显著降低，并很快下降到较低水平，P38总蛋白表达水平无明显变化（图2）。表明P38通路抑制剂SB203580对P38的磷酸化起到了抑制作用。

2.3 SB203580对神经干细胞增殖的影响

加入抑制剂SB203580后，在相差显微镜下观察，实验组可见干细胞球逐渐增大（图3A～C）。15d时可见球中心细胞因缺乏营养坏死，与对照组相比克隆球形状明显增大（图3C，D）。MTT方法测定的细胞增殖曲线可见48h、72h时实验组与对照组比较差异有统计学意义（图4），实验组的细胞增殖率显著高于对照组。

3 讨论

本实验培养了新生大鼠海马神经干细胞，其具有自我更新能力，细胞克隆球Nestin染色呈阳性，证明培养的细胞为神经干细胞［5］。在对单细胞克隆形成的克隆球进行传代后，应用P38通路抑制剂SB203580观察其对神经干细胞增殖的作用，结果发现加入抑制剂后，相差显微镜下可见干细胞球逐渐增大，最终多个克隆球之间连接成片状。MTT方法测定的细胞增殖曲线发现48h、72h时实验组细胞的增殖率明显高于对照组。表明P38通路抑制剂能够促进神经干细胞的增殖。

P38是丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的一种，MAPK是一组广泛分布于各种细胞的细胞质内具有丝氨酸和酪氨酸双重磷酸化的蛋白激酶，其主要成员包括ERK、P38和JNK［6］。现已证实MAPK家族是与细胞增殖调节关系最为密切的细胞内信号传导蛋白激酶，是细胞外信号与细胞核之间信息传导的共同通路［7］。MAPK的激活和多种细胞功能有关，ERK主要介导增殖反应，P38和JNK主要介导细胞的各种应激反应，它们的激活促进凋亡［8］。

本研究在神经干细胞培养过程中加入了P38通路抑制剂SB203580，阻断P38信号转导通路，进而观察P38信号转导通路在神经干细胞增殖中的作用。用Western blot方法检测P38磷酸化水平，发现P38磷酸化水平迅速降低，证明SB203580对P38通路起到了快速的阻断作用。在此基础上观察神经干细胞的增殖情况，相差显微镜下可见，实验组神经干细胞球逐渐增大，15d时可见球中心细胞因缺乏营养坏死，与对照组相比克隆球形状明显增大。MTT法是一种检测细胞存活和生长的方法。其光吸收值可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，细胞增殖越多越快，则吸光度越高。从MTT增殖曲线可以看出，当加入10μmol/L的P38抑制剂时，从细胞增殖曲线上可以看出P38抑制剂对细胞增殖的影响与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05），证实了相差显微镜下观察到的形态学结论。

综合以上实验结果，P38信号转导通路被抑制后，神经干细胞的增殖能力明显增强，提示P38信号转导通路在神经干细胞的增殖过程中起到重要的作用。

［1］Gage FH.Mammalian neural stem cells ［J］.Science，2000，287（5457）：1433-1438.

［2］Yun SJ，Byun K，Bhin J，et al.Transcriptional regulatory networks associated with self-renewal and differentiation of neural stem cells［J］.J Cell Physi，2010，225（2）：337-347.

［3］BrewsterJL，deValoirT，DwyerND，etal.Anosmosensingsignal transduction pathway in yeast［J］.Science，1993，259（5102）：1760-1763.

［4］Haines JD，Fragoso G，Hossain S，et al.P38Mitogen-activated protein kinase regulates myelination［J］.J Mol Neurosci，2008，35（1）：23-33.

［5］Tong L，Ji LL，Wang ZY，et al.Differentiation of neural stem cells into Schwann-like cells in vitro［J］.Bioche Biophy Res Com，2010，401（4）：592-597.

［6］Johnson GL，Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK，JNK，and P38protein kinases［J］.Science，2002，298（5600）：1911-1912.

［7］Boutros T，Chevet E，Metrakos P.Mitogen-activated protein（MAP）kinase/MAP kinase phosphatase regulation：roles in cell growth，death，and cancer［J］.Pharmacol Rev，2008，60（3）：261-310.

［8］Miloso M，Scuteri A，Foudah D，et al.MAPKs as mediators of cell fate determination：an approach to neurodegenerative diseases［J］.Curr Med Chem，2008，15（6）：538-548.

（编辑裘孝琦，英文编辑潘伯臣）

Effects of P38Signaling Pathway on the Proliferation of Rat Neural Stem Cells

TONG Lei，WANG Zhen-yu，JI Li-li，TONG Xiao-jie
（Department of Anatomy，College of Basic Medical Sciences，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo study the effects of P38signaling pathway on the proliferation of neural stem cells （NSCs）from rat hippocampus.MethodsNSCs were cultured in vitro and were divided into control and experimental groups.The control group was cultured in the NSCs media while the experimental group was cultured in NSCs media added with P38inhibitor，SB203580.The expression of P38and phosphorylated P38was detected by Western blot and the proliferation of NSCs was evaluated by MTT.ResultsCompared with the control group，the expression of phosphorylated P38in NSCs was significantly lower.Gradual increase of the NSC spheres was observed in the experimental group，and MTT showed that proliferation speed of NSCs was significantly faster in the experimental group （P<0.05）.ConclusionThe proliferation of neural stem cells significantly increases when P38signal transduction pathway is inhibited.

neural stem cells；proliferation；P38signaling pathway；neonatal rats

R329.28

A

0258-4646（2011）06-0481-03

doiCNKI：21-1227/R.20110602.1639.001

http：//www.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20110602.1639.001.html

国家自然科学基金资助项目（81070011）；辽宁省科技厅社会发展攻关计划（2010225029）；沈阳市科学技术项目计划（F10-149-9-46）

佟雷（1979-），男，讲师，博士.

佟晓杰，E-mail：xjtong@mail.cmu.edu.cn

2011-01-17

网络出版时间：2011-06-2314：51