质谱在生物标志物研究中的应用

彭 翱 ,赵 芊 ,江 骥 ,胡 蓓

(中国医学科学院,北京协和医院临床药理中心,北京 100730)

质谱在生物标志物研究中的应用

彭 翱 ,赵 芊 ,江 骥 ,胡 蓓

(中国医学科学院,北京协和医院临床药理中心,北京 100730)

生物标志物是一个指示剂,可以对其进行测定并用以解释正常生理过程、病理过程及治疗药物的药理学效应,广泛的应用于药物研发和临床诊断中。生物标志物的研究涉及多种技术平台和方法,其中基于质谱的研究方法无论在生物标志物的发现还是确证过程中都有着广泛的应用。本文讨论了基于质谱的研究方法在通常的生物标志物以及阿尔茨海默氏症研究中的进展。

质谱;生物标志物;阿尔茨海默氏症

在过去的10年中,人们对人类疾病的分子基础有了深入的认识,同时也增加了对治愈致死性疾病(如癌症)的期望。然而,随着对疾病认识的增加,新药研发的复杂性和费用呈指数型增加,导致药政管理部门批准新化合物实体的停滞。在这种情况下,美国国立卫生研究院(NIH)发表的“路线图”和美国食品药品监督管理局(FDA)颁布的“启动关键之路”已经指出:“生物标志物”是目前这种危机的潜在“救星”之一。

生物标志物有这样一种特征,它作为一个指示剂,可以对其进行测定并用以解释正常生理过程、病理过程及治疗药物的药理学效应[1]。因为生物标志物可以更可靠、更早期的预测疾病,增加治疗药物对特定目标人群的选择性,并允许实时监测,甚至预测治疗的疗效。对于耗时长、费用高的药物研发过程来说,生物标志物被认为可用于做出继续或终止研发的决策。今后,生物标志物的应用会为个体化治疗的开展铺平道路,尽早确定治疗的获益/风险比,以便更好的保护患者免于不当的治疗。

1 生物标志物的研究方法

生物标志物的研究工作包括发现阶段和验证阶段。当一个生物标志物顺利通过确证后,便可以在临床工作中应用。在传统的研究模式中,生物标志物的发现工作是在基于质谱的技术平台上进行的,而验证及临床应用工作会采用基于配体分析(LBA)的研究技术,如酶联免疫分析(ELISA)。这种研究模式在研究效率上显然并不是很成功,因为它在研究的不同阶段需要涉及到2种或2种以上的,且相互独立的分析方法学。此外,受到关注的是在一些临床情况下,同时应用多个生物标志物具有更好的特异性,对疾病的诊断更加准确[2-5]。这意味着,如果使用配体分析方法,诊断程序将变得更加复杂,给患者带来更大的经济压力。基于以上原因,将生物标志物的研究工作整合在一种技术平台上,既避免了分析方法的多重开发,也更适于临床应用。在众多的分析方法中,质谱技术无疑是理想的候选之一,然而同样面临着相应的挑战。首先,生物标志物的血清浓度动态范围很宽,例如高丰度的白蛋白和一些经典的生物标志物前列腺特异抗原(PSA)的浓度可相差108～1 010倍,如果要对这些低丰度蛋白进行准确度和精密度都符合要求的定量,样本酶解前的预分离是非常重要的。样本预分离通常采用液相色谱完成,使用反向及亲和两种不同原理的色谱技术去除不相关的高丰度蛋白,保证丰度低的潜在生物标志物的测定不受影响。另一种挑战来自对翻译后修饰(PTM)的特殊蛋白的定量分析,主要解决方法包括:亲和吸附、对目标病变组织分析,稳定同位素标记技术(ICAT,iTRAQ)。生物标志物研究的不同阶段的质谱方法和技术列于表1。

表1 生物标志物研究的主要阶段以及涉及到的质谱方法和技术Table 1 The biomarker development pathw ay,indicating the nature of the analysis in the three phases of discovery,validation and clinical application

生物标志物的确证对获得合格的生物标志物以及将其成功应用到临床工作中是至关重要的。在欧洲,所有收集受试者标本进行生物标志物测定的临床试验都必须报告管理当局,实验室的测定过程被要求依从全面的质量控制。为落实当局的要求,生物标志物的分析不得不经历全面的方法学考核。美国药学科学家协会(AAPS)和美国临床配体分析协会(CLAS)将生物标志物的分析方法分为以下4类[6-8]:1)绝对定量分析使用标准曲线和回归模型来计算未知样本中的绝对定量值,其中标准品能够完全体现和代表生物标志物;2)使用响应-浓度标准曲线进行相对定量分析,但标准品不能完全代表生物标志物;3)半定量分析中不采用标准曲线,但是待测样本能够以连续响应结果进行表达;4)定性分析可以是定序结果(ordinal data),如免疫组化,或者是适用于判断是/否的定类结果(nominal data)。不同生物标志物分析需要对不同的指标进行验证,目前对不同类型的生物标志物分析所需要的考核内容列于表2。在生物标志物的方法学考核中,有两种基本生物分析指导原则可以参考:其一是FDA颁布的适用于药物生物分析的指导原则;另一个是美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)和临床实验室改进法案(CLIA)颁布的适用于临床诊断分析的指导原则。此外,Lee等[6-8]对生物标志物分析的方法学验证也进行了全面的总结。

近年来,质谱技术在灵敏度、特异性、研究方法和通量方面的优势,使其广泛的应用到生物标志物的研究中。

表2 生物标志物的分析类型及考核内容Table 2 V alidation characteristics of various assay proformance categories of assay

2 阿尔茨海默氏症中生物标志物的研究进展

过去的25年中,对阿尔茨海默氏症(Alzheimer’s disease,AD)的基础以及临床研究使我们对这种疾病的分子机理和临床病理有了详细的认识。阿尔茨海默氏症是一种复杂的持续性过程,相互影响的病理级联反应相继出现,其中包括β-淀粉样肽(Aβ)的聚集与斑块发展的相互影响,以及τ蛋白的过磷酸化和聚集与缠结形成的相互作用。连同其他的病理过程,如炎症和氧化应激,这种病理级联过程最终导致突触结构的丢失,以及进行性的神经退行性病变。随着该领域研究的进展,部分研究结果已经进入候选药物的研究阶段,其中大部分已经进入2期临床试验研究,均为缓解疾病症状的药物。从转基因小鼠模型的研究结果可以看出,这一类缓解疾病的新药在Aβ聚集过程的早期更加有效,而在严重斑块形成和神经退行性病变的晚期则疗效较差。但是,目前用于鉴别阿尔茨海默氏症患者的诊断标准仅能诊断出神经病理处于晚期的患者,因此需要提升对疾病早期发现的能力。如果能够早期发现并进行1年的干预痴呆性治疗,预计到2050年阿尔茨海默氏症的患病率会从8 000万降至900万。

阿尔茨海默氏症的生物标志物可以分为两类:首先是核心生物标志物,它能够反映疾病的基本发病特征,例如淀粉样前体蛋白(APP)和Aβ的非正常代谢;其次是下游生物标志物,它能够反应下游的病理现象,例如轴突变性。目前主要以脑脊液(CSF)为阿尔茨海默氏症生物标志物的研究对象,脑脊液生物标记物能够反映大脑神经化学的变化,并且可以通过腰椎穿刺获得样本,且无明显的副作用。相对于脑脊液生物标记物,很少能成功的在外周血液中寻找到生物标志物。事实上,许多已发表的血液生物标志物,在接下来的研究中被证实其诊断价值不高。血浆中的Aβ40和Aβ42虽然可以被测定,但是外周Aβ水平并不能反映大脑中Aβ的变化。

在大量研究中得到确证的脑脊液生物标志物包括:Aβ40,Aβ42,总τ蛋白和磷酸化τ蛋白。其中,Aβ40,Aβ42和磷酸化τ蛋白能作为核心标志物反映阿尔茨海默氏症疾病过程大脑的淀粉样病变以及皮质神经纤维缠结;相反,总τ蛋白是反应轴突损伤的非特异性标志物,它能够反映神经变性的过程。在对阿尔茨海默氏症不同阶段患者的生物标志物研究中,脑脊液中总τ蛋白和磷酸化τ蛋白水平升高,以及 Aβ42或Aβ42/Aβ40降低的综合评价是较为可靠的生物标志物,这种综合评价的灵敏度大于95%,特异性大于85%。采用脑脊液生物标志物的综合诊断已经在3个多中心研究中得以验证。此外,还有大量的潜在生物标志物能够反映阿尔茨海默氏症原发和继发的病理改变。其中,反映病理进程的标志物包括β位点淀粉样前体蛋白清除酶1(BACE1)活性和浓度,Aβ降解产物;反映次要事件的标志物包括氧化应激反应和炎症等,对这些标志物潜在诊断价值的研究相对较少。但是,BACE1活性以及APP异构体对某些候选药物的生化作用给了重要的信息,例如BACE1抑制剂。

鉴于Aβ在阿尔茨海默氏症淀粉样病变级联学说中的中心地位,定量研究在生物标志物确证中有着重要的意义。Aβ容易自我聚集,或结合于其他蛋白或玻璃表面,使得 ELISA分析变得相对困难。此外,Aβ可能经过翻译后修饰以及与脑脊液中内源组分产生交叉反应使ELISA分析变得复杂。同样,LC/MS法也存在挑战,Aβ的疏水性强,容易吸附在样本管、进样器以及色谱柱上,这对质谱分析造成了很大影响。但通过对液相条件进行优化可以改善Aβ聚集的问题,如在反向系统结合碱性洗脱条件下,Aβ的保留行为和回收率可以得到明显提高[9-10]。

通过选择特定的质谱分析器以及相应的扫描模式可以提高对Aβ的分析能力。通常,串联质谱是分析复杂多肽混合物的有效方法,相同质量分析器的串联质谱包括三重四极杆(QQQ)、3D离子阱(3D ion traps)、线性离子阱(linear ion traps)和串联飞行时间(TOF-TOFs);结合不同质量分析器的串联质谱在Aβ的分析中具有更好的能力和表现,其中包括四极杆-时间飞行(Q-TOF)、四极杆-线性离子阱(Q-ion trap)和线性离子阱-傅里叶转换离子回旋共振(L TQFTICR)。而采用L TQ的全扫描方式是Aβ定量分析的理想选择。采用这种分析方法,数据处理灵活,且可获得肽段离子的精确质量数[11-12]。针对Aβ42和Aβ40的特异性可以选择 Q-L TQ串联质谱分析系统,扫描模式采用子离子扫描(PI),而非选择离子扫描(SIM)[10]。在该类研究中,选择离子扫描无法满足特异性的要求,因为生物基质中可能存在与Aβ具有相同质荷比的内源性干扰。而通过选择特定的母子离子对能够提供更高的特异性。此外,串联四极杆质谱的多反应监测(MRM)也可以用于多肽的质谱分析,但是,Q-L TQ质谱的增强子离子扫描(EPI)能够提供更高的灵敏度。另外,由于某些酶的化学修饰作用,Aβ的定量分析可能变得非常复杂,出现无法解释的Aβ种类[12],导致对Aβ影响的错误估计[13]。传统的MALDI/MS分析使用溶剂会导致对Aβ42中亲水部分的过高响应,而两性部分无质谱响应。随着MALDI技术的发展,可以不使用溶剂,这样过高响应和过低响应均会降低,不会给Aβ的测定带来明显影响[14]。在没有标准品的情况下,固相分析是蛋白质分析的有力工具,而MALDI相对于 ESI的优势是其电离是静态的,这样使其能够轻易地应用到微阵列的分析中。此外,无论化合物相对分子质量的大小,MALDI能够提供单电荷分子离子,这使得质谱解析变得简单。

3 结论

随着质谱技术的发展,其在应用的灵活性、研究通量、准确度和灵敏度都具有独特的优势。在生物标志物的研究过程中,对潜在生物标志物的确证是非常重要的,严格和认真的生物标志物确证工作是应用质谱进行生物标志物研究的关键。同时,只有良好的整合科研与临床工作,生物标志物的研究才会取得成功。

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Mass Spectrometry in Biomarker Investigation

PENG Ao,ZHAO Qian,J IANGJi,HU Pei
(Clinical Pharmacology Research Center,Peking Union Medical College Hospital,Chinese Academy of Medical Science,Beijing100730,China)

A biomarker is a characteristic,which is objectively measured and evaluated as an indicator of normal biological processes,pathogenic processes or phar macologic responses to a therapeutic agent.They were increasingly used in drug development and clinical diagnostics.There were several platforms and methods used in biomarker investigation,and the mass-based methods had their contribution from the discovery stage to the qualification stage of biomarker investigation.In this review,we discussed the mass-based methods in general biomarker investigation and Alzheimer’s disease.

mass spectrometry;biomarker;Alzheimer’s disease

O 657.63

A

1004-2997(2011)01-0031-05

2010-12-08;

2011-01-17

彭 翱(1979～),男(汉族),湖南人,博士,临床药理学专业。E-mail:mailpeng@yahoo.com.cn

胡 蓓(1956～),女(汉族),四川人,教授,博士生导师,临床药理学专业。E-mail:pei.hu.pumc@gmail.com