益气活血法对脑出血大鼠脑组织Ⅳ型胶原表达的影响

罗 娟 唐 涛 吴 季 周华军 吴 婧 (中南大学湘雅医院中西医结合研究所，湖南 长沙 410008)

益气活血法对脑出血大鼠脑组织Ⅳ型胶原表达的影响

罗 娟 唐 涛 吴 季 周华军 吴 婧 (中南大学湘雅医院中西医结合研究所，湖南 长沙 410008)

目的 探讨益气活血中药对脑出血大鼠脑损伤区组织Ⅳ型胶原表达的影响及其作用机制。方法 150只SD大鼠被随机分为假手术组、模型组、益气活血组、益气组和活血组各30只。用Ⅶ型胶原酶诱导脑出血大鼠模型。各组相应灌服蒸馏水、益气活血法代表方补阳还五汤全方及其益气组分、活血组分药物。用免疫组化方法检测术后3、7、14、21 d和28 dⅣ型胶原的表达，其结果进行平均光密度扫描半定量分析。结果假手术组不同时间点Ⅳ型胶原表达未见明显阳性信号;模型组、益气组、活血组及益气活血组脑出血后3 d即有Ⅳ型胶原表达，模型组及益气组至21 d达到高峰，随后开始下降;活血组及益气活血组表达高峰时间提前至14 d，并至21 d时仍维持一定的表达水平;各个时间点益气活血组表达均高于其他组。结论 益气活血中药可能通过增强脑出血后血肿周围脑组织Ⅳ型胶原的表达参与组织修复。

脑出血;血管新生;Ⅳ型胶原;免疫组化;益气活血法

脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)发病率虽占所有类型脑血管病的30%，但其以50%以上的病死率高居首位，40%的存活者留有严重残疾，是临床的危急重症〔1〕。而脑出血患者中老年人所占比重很大。研究证实，脑出血血肿区及其周边区局部脑血流量下降，是导致临床症状恶化、影响脑水肿吸收消散的重要原因〔2〕，因此治疗脑出血应早期改善脑部供血，以防止出现缺血性脑损伤。而通过血管新生促进血肿区及其周边区微血管网重建，改善损伤区微循环，可能防治继发性缺血损伤，并减轻生物活性物质对脑组织的损害，还可能为损伤神经元的修复、突触重建和神经发生创造良好的微环境，进而为神经功能的恢复奠定基础〔3〕。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)主要是由胶原(collagens)、连接糖蛋白等不溶结构成分混合而成的组织特异性三维结构〔4〕;其组成是动态变化的，脑出血后血液流出和血脑屏障破坏，改变血管周边的ECM组成、血管-ECM间的结构关系〔5，6〕。本实验用益气活血治法经典方剂补阳还五汤及其益气、活血组分分别进行干预，观察益气活血方药对出血后脑组织中细胞外基质成分Ⅳ型胶原表达的影响，初步探讨其在脑出血微血管系统重建过程中的作用机制，为益气活血治法在脑出血中的治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康清洁级SD大鼠150只〔许可号:SCXK(湘)2006-0002〕，雄性，体质量(220 ±20)g，鼠龄8～12 w，动物及饲料均购自中南大学实验动物中心。

1.1.2 药物与主要试剂 补阳还五汤全方(黄芪∶赤芍∶当归∶川芎∶桃仁∶红花∶地龙用量按照20∶3∶3∶2∶3∶3∶3比例)、补阳还五汤益气组分(黄芪)与补阳还五汤活血组分(赤芍、当归、川芎、桃仁、红花、地龙)采用粉末制剂，与蒸馏水配成溶液后浓度为全方 0.44 g/ml，益气 0.225 g/ml，活血 0.215 g/ml。Stoelting TL-2鼠脑立体定位仪(美国);Leica1850恒冷冰冻切片机(德国);Ⅶ型胶原酶(Sigma公司);Ⅳ型胶原多克隆抗体(Santa Cruz公司);辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(二抗)，亲合素-生物素酶复合物(ABC)试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自北京中杉生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 脑出血动物模型制备〔7〕腹腔注射体积分数为10%的水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠，俯卧位固定于鼠脑立体定位仪上，按无菌操作原则，于前囟后1.4 mm、旁开3.2 mm、深5.6 mm处(位于近内囊的苍白球内)微量进样器缓慢注入0.5 U的Ⅶ型胶原酶灭菌生理盐水2.5μl。假手术组以同样方法在此点注入灭菌生理盐水2.5μl。造模成功后均表现为行动迟缓，拖步行走，旋转爬行，容易激惹，半侧偏瘫，前爪抓力下降等。

1.2.2 动物分组及处理 150只SD大鼠按随机数字表法分成5组:假手术组、模型组、益气组、活血组、益气活血组，各组30只。其中假手术组与模型组均给予蒸馏水灌胃，每次2 ml，每日2次;益气组、活血组和益气活血组分别用各自方药2 ml，各组于术后3、7、14、21 d和28 d各随机抽取6只大鼠，用10%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，经升主动脉灌注4℃的多聚甲醛10 m l/min，取脑。各组每个时间点取6只大鼠的标本，在相同的固定液中固定4 h，依次放入质量分数为20%、30%蔗糖溶液沉底，放入Leica1850恒冷切片机行连续冠状切片，片厚30μm，抗冻存缓冲液保存置入－20℃冰箱备用。

1.2.3 免疫组化ABC法检测Ⅳ型胶原阳性表达及图像分析冰冻切片于室温中复温，用3%的过氧化氢-甲醇室温下浸泡10 min;5%的牛血清白蛋白37℃封闭60 min;滴加Ⅳ型胶原多克隆抗体(1∶500)，37℃孵育60 min，4℃过夜;滴加二抗兔抗山羊 IgG(1∶200)和 ABC 复合物(1∶100)，37℃ 各孵育 60 min;DAB镜下控制显色，脱水，透明中性树脂封片。除滴封闭液时不洗外，各步骤间用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min×3次。用PBS代替一抗作实验对照。免疫组化阳性表达染色为棕褐色。用Motic Images Advance 3.2图像分析软件计数，在光镜下(400倍)每只大鼠随机选择3张片，每张片选择3个互相不重叠的视野，共9个视野进行分析，测定其阳性面积(mm2)和平均光密度(OD)值，以二者乘积代表Ⅳ型胶原表达水平，取平均数作为一只大鼠计数结果。

1.3 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行处理，计量资料以±s表示，组间比较用单因素方差分析，方差齐时，采用LSD检验;方差不齐时，采用Dunnett's T3检验。

2 结果

假手术组不同时间点Ⅳ型胶原未见明显阳性表达;其余各组3～28 dⅣ型胶原表达水平升高;模型组、益气组、活血组及益气活血组在脑出血后3 d即有Ⅳ型胶原表达，并逐渐增强，血肿周围有少量不规则血管段出现，且以益气活血组最明显;模型组及益气组在21 d表达达到高峰，随后开始下降，益气组各时间点均较模型组增强(P＜0.01);活血组各时间点表达增强，14 d时达到高峰，并高于同时间点模型组和益气组(P＜0.01);益气活血组Ⅳ型胶原表达水平于14 d达到高峰，其他时间点的表达也高于其他组(P＜0.01，P＜0.05)，血肿区可见明显血管段成条索状，对应出现管腔扩大，血肿区血管阳性段的表达最明显。见图1，图2。

图1 假手术组及益气活血组各时间点血肿区血管新生情况

图2 益气活血法对脑出血大鼠Ⅳ型胶原表达的影响

3 讨论

脑出血作为老年人多发疾病，能否在有效时间窗内救治并获得良好预后，对于提高患者的生活质量有着重要的关系。脑出血属祖国医学“中风”范畴，气虚血瘀是该病的基本病机，“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留血瘀”，故中医多以益气活血法治疗脑出血，其代表方剂为清代名医王清任创立的补阳还五汤。方中重用黄芪以大补元气，取气旺血行之义，为君药;当归尾是当归的尾梢部分，破血之力甚强，活血祛瘀而不伤血，为臣药;赤芍、川芎活血行气，桃仁、红花活血通经祛瘀，为行血活血之要药，四药合用，协同当归尾活血祛瘀，同为佐药;地龙其性走窜，通经活络，配合以上诸药以行药势，为使药。全方合用，使气旺血行，祛瘀通络，以通为补，以补为通，通补兼施，共奏益气活血之功效。

脑出血后微血管系统重建对于脑组织修复、神经元抗损伤、神经功能恢复是极其重要的〔8〕，在此过程中，ECM与血管新生相互作用，即血管新生可以导致ECM成分的降解、重塑，而ECM对新生血管内皮细胞增殖、迁移、存活和新生血管成型、成熟有重要作用〔5〕。

Ⅳ型胶原是细胞外基质的重要成分，是一种网状胶原，主要存在于毛细血管和大血管腔的基底膜中，也参与到血管新生中〔9〕。本实验中，3 d时即出现了Ⅳ型胶原的表达;7 d时，益气活血组Ⅳ型胶原的表达开始高于其他三组;到14 d时，Ⅳ型胶原的表达达到高峰，较模型组、益气组和活血组的表达提前，提示益气活血法对脑出血后Ⅳ型胶原表达的促进作用更早;21 d时，益气活血组Ⅳ型胶原的表达仍要高于其他三组，此时阳性血管管腔较前期明显增宽并出现分支，提示21 d后益气活血组脑出血大鼠所表现的血管腔化作用明显增强，进入血管生成的塑型阶段;28 d时，益气活血组与活血组Ⅳ型胶原仍维持较高水平的表达，并高于模型组及益气组同期水平，说明益气活血法与活血法均能延缓Ⅳ型胶原的下降，维持微血管新生过程，促进大鼠的神经功能恢复。

目前对Ⅳ型胶原的调节机制研究较多、也得到公认的是基质金属蛋白酶(matrixmatalloproteinases MMP)，尤其是MMP-2、MMP-9。聂亚雄等研究证明脑缺血后MMP-2和MMP-9表达上升，但脑溢安可下调其表达〔10〕，韩梅等进行的研究显示益气活血化瘀治疗能下调碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血管内皮剥脱诱导的MMP-2表达，减轻胶原降解，进一步说明益气活血化瘀中药能同时在多环节、多位点上抑制血管内皮损伤引起的 ECM 重塑〔11〕。

已有研究证实，在脑出血过程中，应用益气活血中药可上调血小板反应蛋白(TSP)-1及TSP-2的表达，而TSP-1及TSP-2可抑制MMP-2、MMP-9的表达〔12〕，作为主要降解Ⅳ型胶原的酶MMP-2、MMP-9的减少可促进Ⅳ型胶原合成增加，进而更促进了血管新生的增加及血管稳定。

综上所述，本研究显示益气活血法和活血法均能对Ⅳ型胶原有不同时相的上调作用，且益气活血法的疗效优于活血法和益气法，活血法疗效优于益气法，提示益气法与活血法合用的补阳还五汤由于其二者的协同作用，增强了其促进Ⅳ型胶原的表达，促进内皮细胞的增殖及迁移，加速微血管的新生，有利于恢复病灶区的血液灌注。

1 Liu M，Wu B，Wang WZ，et al.Stroke in China:epidemiology，prevention，andmanagement strategies〔J〕.Lancet Neurol，2007;6(5):456-64.

2 Hua Y，Keep RF，Hoff JT，et al.Brain injury after intracerebral hemorrhage:the role of thrombin and iron〔J〕.Stroke，2007;38(2):759-62.

3 Greenberg DA，Jin K.From angiogenesis to neuropathology〔J〕.Nature，2005;438(7070):954-9.

4 Caffo M，Germano A，Caruso G，et al.An immunohistochemical study of extracellularmatrix proteins laminin，fibronectin and type IV collagen in paediatric glioblastoma multiforme〔J〕.Acta Neurochir(Wien)，2004;146(10):1113-8.

5 Rhodes JM，Simons M.The extracellularmatrix and blood vessel formation:not just a scaffold〔J〕.JCell Mol Med，2007;11(2):176-205.

6 Xi G，Keep RF，Hoff JT.Mechanisms of brain injury after intracerebral haemorrhage〔J〕.Lancet Neurol，2006;5(1):53-63.

7 Rosenberg GA，Mun-Bryce S，Wesley M，et al.Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats〔J〕.Stroke，1990;21(5):801-7.

8 Kalra L，Ratan R.Advances in stroke regenerative medicine 2007〔J〕.Stroke，2008;39(2):273-5.

9 Khoshnood J，Pedchenko V，Hudson BG.Mammalian collagen Ⅳ〔J〕.Microsc Res Tech，2008;71(5):357-70.

10 聂亚雄，朱云龙，霍瑞民，等.脑溢安对脑缺血大鼠脑组织MMP-2，9表达的影响〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志，2009;7(8):936-7.

11 韩 梅，温进坤，周秀霞.益气活血化瘀方药对血管胶原转换及相关基因表达的影响〔J〕.中国中西医结合杂志，2004;24(2):136-9.

12 齐 勇，唐 涛，罗杰坤，等.益气活血治疗对脑出血大鼠脑内TSP-1、TSP-2及其受体CD36表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2007;27(10):913-6.

Effect ofmethod of supplementing Qiand activating blood circulation on the expression of typeⅣcollagen in brains of intracerebral hemorrhage rats

LUO Juan，TANG Tao，WU Ji，et al.
Xiangya Hospital Central-South University，Changsha 410008，Hunan，China

Objective To investigate themechanisms ofmethod of supplementing Qiand activating blood circulation on the expression of typeⅣ collagen in brains of intracerebral hemorrhage(ICH)rats.M ethods ICH modelwas induced by injecting collagenase typeⅦstereotaxically into rightglobus pallidus.One hundred and fifty SD ratswere randomly divided into shame operation，ICH model，supplementing Qi，activating blood circulation，supplementing Qi and activating blood circulation groups ，each group had 30 cases.The last 3 treated groups were administered orally with the classicmethods of supplementing Qiand activating blood circulation prescription of Buyang Huanwu decoction.The expressions of type Ⅳ collagen were assayed by immunohistochemistry on 3，7，14，21 and 28 days after the onset，then the average optical density of the positivemicrovessels were counted.Results No hematoma and obvious local pathological changes were appeared in brain tissues of sham operation group at different time points during the experiment.Microvascular angiogenesis of supplementing Qi and activating blood circulation group wasmore than thatof supplementing Qi，activating blood circulation andmodelgroups.Immunohistochemical researches showed thatatdifferent time points，the expression of typeⅣ collagen had no significant changes in sham operation group.The expressions of type Ⅳ collagen in model and threemedically treated groupswere observed on 3 day，the expressionswere increased gradually，peaked on 21 day in supplementing Qiand model groups，and then started to decrease.The peak time of activating blood group and supplementing Qi and activating blood circulation group were advanced on 14 day，and the expressions sustained high levels to 28 day.Conclusions Themethod of supplementing Qiand activating blood circulation can up-regulate the expressions of typeⅣcollagen after ICH to participate in the tissue repair.

Intracerebral hemorrhage;Angiogenesis;TypeⅣ collagen;Immunohistochemistry;Method of supplementing Qiand activating blood circulation

R743.3

A

1005-9202(2011)15-2882-03

国家自然科学青年基金(No.30400581，30873221)

唐 涛(1972-)，男，副教授，副主任医师，硕士生导师，主要从事脑血管疾病中西医结合基础与临床研究。

罗 娟(1985-)，女，硕士，医师，主要从事脑血管疾病中西医结合基础与临床研究。

〔2010-09-28收稿 2010-12-20修回〕

(编辑 袁左鸣/徐 杰)