人横纹肌样脑膜瘤细胞株的分离和鉴定

胡德志 王晓梅 毛颖 周良辅

人横纹肌样脑膜瘤细胞株的分离和鉴定

胡德志*王晓梅*毛颖*周良辅*

目的 人横纹肌样脑膜瘤(rhabdoid meningioma，RM)是一种少见的难治性中枢神经系统肿瘤。为建立其体外研究模型，本实验拟从1例确诊的横纹肌样脑膜瘤中分离和鉴定横纹肌样脑膜瘤细胞株。方法 利用贴壁培养和肿瘤球培养结合的方法，分离细胞株。利用流式细胞术分析表面抗原标志。用XTT法检测细胞生长活性。用体内移植方法评估其致瘤能力。结果 分离培养得到一细胞株，其表面标志为CD44+CD59+CD105+CD11a－CD31－Cd34－，与间质前体细胞具有相似性。其在体外具有长期传代能力，目前已经传了50余代。体内移植试验表明1×105以上细胞具有较一致的颅内致瘤能力，获得的移植瘤与原发人肿瘤具有相似的组织学特征。结论 我们首次分离了1例具有间质细胞特征并具有致瘤性的横纹肌样脑膜瘤细胞株，为恶性脑膜瘤的研究提供了一个体外模型。

横纹肌样脑膜瘤 细胞株 间质细胞

横纹肌样脑膜瘤(rhabdoid meningioma，RM)是WHO III级脑膜瘤的一种类型，是难治性肿瘤，经过手术切除辅以放、化疗治疗后，肿瘤仍易复发，预后差［1－3］。目前对该疾病的临床和病理特征有一定的研究，但是对其发病机制却罕有讨论。这很可能与缺乏该肿瘤的实验模型有关。通过本实验，我们建立了首例人横纹肌样脑膜瘤的细胞株，为该肿瘤的研究提供了体外模型。

1 材料与方法

1.1 研究对象 本研究征得患者同意以及复旦大学华山医院伦理委员会批准。新鲜肿瘤标本来自1例59岁的男性横纹肌样脑膜瘤(rhabdoid meningioma，RM)患者。磁共振显示右中颅底有一注射造影剂后有强化的肿瘤，瘤周有中度水肿。术中见肿瘤基底在颅底硬膜，肿瘤全切除。术后切片病理检查显示局部有横纹肌样变的特征，表现为偏离中心的细胞核和偏多的嗜酸性染色的细胞浆。其他区域见不典型脑膜瘤的特征，包括局部上皮膜抗原(epithelialmembrane antigen，EMA)阳性染色，vimentin(VIM)阳性染色和高于10%的 Ki-67有丝分裂指数(图 1)。GFAP，MNF116，HMB45，S-100，CK，desmin和 SMA染色阴性，可排除胶质瘤、黑色素瘤、转移性肉瘤及不典型畸胎瘤。

图1 人原发肿瘤组织学分析。A:人冠状位MRI，可见有左中颅底明显增强的肿块;B:术中照片，肿瘤基底在中颅底硬膜;C:人肿瘤标本石蜡切片HE染色，见横纹肌样细胞，特征为细胞核偏中心分布，且胞浆巨大，嗜酸性;D，E，F:人肿瘤标本免疫组化染色，见肿瘤细胞局灶性表达EMA和VIM。Ki-67有丝分裂指数 ＞10%;C，D，E，F(× 400，Scale bar=100 μm)

1.2 细胞培养 采用的细胞培养液均为不含血清的DMEM(Gibco)，添加了 N2(1∶100，Sigma)，heparin(5μg/mL，Sigma)，EGF和 bFGF(均为 20 ng/mL，Sigma)，insulin(20 ng/mL，R＆D system)，B27(1%，Invitrogen)，以及 hLIF(100 ng/mL，R＆D system)。新鲜肿瘤组织在去除血管和蛛网膜后，经锐性碎化及胶原酶(0.1%，Sigma，37℃)分解后离心(2100 r/min，4℃)，弃上清重悬浮于200μL PBS，所获得的单细胞悬液再经滤孔直径为37μm细胞滤网 (Falcon)滤过。然后将此细胞接种于75 cm2塑料培养瓶，接种密度为1×106细胞/cm2。24h后将非贴壁细胞去除，贴壁细胞3～4 d换液一次。待贴壁细胞成片后，胰酶消化传代培养。传到第四代时，将贴壁细胞消化后转移到超低粘附六孔板，进行肿瘤球(tumor sphere)培养。细胞接种密度为3×105个/cm2。肿瘤球连续培养至第三代后收集肿瘤球，分散细胞，转移至塑料培养皿再行贴壁培养。

1.3 流式细胞仪分析 使用流式细胞仪检测分离培养的细胞的表面抗原［4］。细胞先与荧光素结合的抗体以及同型对照抗体一起孵育。洗涤后重新悬浮于1 mL HBSS中。在分析前添加 2μL propidium iodide(PI;Calbiochem，100μg/mL)。每种抗原分析重复5次实验。

1.4 细胞动力学 细胞扩增活性用2，3-bis(2-methoxy-4-nitro-5Vsulfop henyl)-5-［(phenylamino)carbonyl］-2H-tetrazolium hydroxide(XTT)法［5］检测，并绘制成细胞生长曲线。

1.5 体内移植试验 收集对数生长期的细胞，制成单细胞悬液。10μL细胞悬液(含1×102～1×106细胞)注射到BALB/c裸鼠颅内。裸鼠出现明显的消瘦以及神经系统症状时，处死裸鼠观察有无移植瘤形成。移植瘤行切片分析了解其组织学特点。

1.6 组织病理分析 用HE染色和过氧化物酶染色法进行组织病理分析。石蜡切片脱蜡后在柠檬酸盐缓冲液(PH 6)中以微波加热，并以3%BSA封闭非特异性抗体后与一抗(EMA 1∶100，Signet;VIM 1∶200，Covance;SOX2 1∶100，Abgent;Ki-67 1∶100，Saierbio;GFAP 1∶100，Abgent;SMA 1∶100 Abcam，ScienCell;desmin 1∶100，Biolabs;MNF116 1∶100，Abcam;HMB45 1∶100，Abcam;CK 1∶200，Abcam)孵育过夜，与生物素结合的二抗作用30 min，再与过氧化物酶复合物作用30 min。设对照(不加一抗)。

1.7 细胞染色体分析 按照文献［6］方法进行细胞遗传学分析。利用彩色荧光原位杂交(M-FISH)对间期、中期染色体进行处理、照相，再进行核型分析和染色体异常分析。

2 结果

2.1 细胞株RM-A的分离 我们将原代细胞接种于添加了上述一些生长因子的无血清培养基中。这种培养基不适合分化细胞的生长。20～30 d后，贴壁细胞长成片。3～4代后，贴壁细胞呈现成纤维样或扁平样形态，并观察到不少肿瘤球样的细胞球(图2A，B)。为了获得大量的肿瘤球，我们将贴壁细胞分散制成单细胞悬液，并转种到超低粘附六孔板。15d后观察到许多悬浮肿瘤球，其直径介于50～500μm(图2C，D)。

图2 原代细胞贴壁培养和肿瘤球培养。原代肿瘤细胞在无血清培养液中贴壁培养传代后，再转移至超低粘附六孔板行肿瘤球培养。A:原代培养的贴壁细胞。在塑料培养瓶里，接种30 d后，贴壁细胞长成片;B:在贴壁细胞传代培养后，可以观察到贴壁的肿瘤球;C，D:在超低粘附六孔板中的悬浮肿瘤球。将贴壁细胞转移到超低粘附六孔板中以同样培养液培养，15 d内形成许多悬浮的肿瘤球。(×100，Scale bar=50μm)

将肿瘤球连续培养，第三代后重新收集于塑料培养瓶中贴壁、扩增，该培养系统至今已经超过50代的传代，倍增时间约3～4 d。将该细胞培养物命名为RM-A。XTT法测得的RM-A细胞生长曲线如图所示(图3)。

2.2 RM-A细胞表面抗原检测 用流式细胞仪检测发现CD59和CD44在所有细胞表达;CD31，CD11a和CD34在所有细胞均不表达;CD105表达率介于18.3%～25.7%(图4)。除CD105表达较低，这种表面抗原组合与以往在间质干细胞中发现的相似。

2.3 RM-A细胞致瘤能力 1×105及 以上细胞注射到裸鼠颅内后，可以观察到致瘤性。接受1×105注射的6只裸鼠，有4只产生了颅内肿瘤。而1×104及以下细胞注射到颅内后则没有观察到致瘤性。移植瘤的组织病理分析发现:①横纹肌样变;②VIM和 EMA染色阳 性;③ GFAP，MNF116，HMB45，S-100，CK，desmin和SMA染色阴性。见图5。

2.4 RM-A细胞的染色体异常 对RM-A的染色体分析发现有二倍体、四倍体和非整倍体。进一步的分析发现有广泛的染色体异常，但最常见的是1号、11号和22号染色体异常。见图6。

图3 XTT法测得的细胞生长曲线。Error bar表示标准误

图5 接种瘤的组织学分析。A:颅内接种RM细胞后20d产生的接种瘤。B，C，D:裸鼠脑组织切片HE染色，可见横纹肌样细胞。E，F:接种瘤石蜡切片免疫组化分析发现EMA和VIM的局灶性表达。B(× 10，Scale bar=10μm);C(× 40，Scale bar=20μm);D，E，F(× 400，Scale bar=100μm)

图6 对一个四倍体核型的中期染色体分析结果:80＜4n＞，XXYY，－1，der(1)t(1;6)(p10;p?10).fishder(1)t(1;6)(wcp1+，wcp6+)，－5，+7，－8，－9，－10，－10，der(11)t(11;20)(q?23;q12).fishder(11)t(11;20)(wcp11+ ，wcp20+)，－ 12，der(12)t(12;y)(?;?).fishder(12)t(12;y)(wcp12+，wcpy+)，－13，－14，－14，－15，－15，der(15)t(12;15)(q?;12q?23).fishder(15)t(12;15)(wcp12+，wcp15+)，der(15)t(12;15)(q?;12q?23).fishder(12)t(12;15)(wcp12+，wcp15+)，+16，－17，－19，－19，－19，－22，+mar1.fishder(?5)t(5;22)(wcp5+，wcp22+)，+mar2.fishder(13)t(13;1;15)(wcp13+，wcp1+，wcp15+)，+mar2.fishder(13)t(13;1;15)(wcp13+ ，wcp1+ ，wcp15+)

图4 流式细胞仪检测结果。L分别为CD59，CD44，CD105，CD11a，CD31，CD44;R表示同型对照。

3 讨论

作为恶性脑膜瘤的一种亚型，横纹肌样脑膜瘤的临床病理特征已经有不少报告。但是由于缺乏稳定的研究模型，限制了对其发病机制的深入研究。而本研究则从1例横纹肌样脑膜瘤的新鲜标本中分离了具有致瘤性的细胞株。

迄今为止见于报道的脑膜瘤细胞株非常少。良性脑膜瘤由于其细胞分裂缓慢的特点，其建株必须将细胞作永生化处理，因此难以反应自然的真实的细胞活动状态，在科研活动中应用价值不高［7］。目前在研究中应用较广的是Lee等多年前建立的恶性脑膜瘤细胞株［8］。Lee的细胞株建立之时，脑膜瘤的病理分型与如今是有很大不同的。近年脑膜瘤病理分型趋于细化，增加了诸如横纹肌样脑膜瘤等新的病理类型。因此，回头看Lee的细胞株，不能确定其来源脑膜瘤的确切病理类型。本细胞株的一个重要特点是，它明确代表了横纹肌样脑膜瘤。

本细胞株另一个重要特点是其具有间质细胞特征的表面抗原组合。这在以往的脑膜瘤细胞株中从未见过描述。这一发现的意义在于表明横纹肌样脑膜瘤很可能是上皮－间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的产物。脑膜瘤被认为起源于蛛网膜细胞。那么，蛛网膜细胞是如何转化为脑膜瘤细胞的?有研究发现，在神经纤维瘤病II型(neurofibromatosis type 2，NF2)基因缺失的老鼠中，脑膜瘤发病率非常高。NF2基因编译一种被称为Merlin的蛋白分子，而Merlin的缺失则导致EMT［9］。EMT是许多肿瘤发生的早期过程。当然，若要证实横纹肌样脑膜瘤是EMT的产物，必须建立蛛网膜细胞通过EMT诱导转化为脑膜瘤细胞的模型，本研究则只是提供了这种推论的一个重要证据。

用于建立本细胞株的细胞培养方法也有别于其他脑膜瘤细胞株。即我们采用了目前用于分离肿瘤干细胞常用的无血清肿瘤球培养方法。目前，有不少实体瘤的肿瘤干细胞均是采用这种方法分离得到的［10］。从采用的方法来看，我们获得的细胞株可能具有肿瘤干细胞的性质。本研究的局限是，尚未对建立的细胞株进一步进行克隆化培养，多潜能分化诱导试验，以及该肿瘤的其他细胞群的比较研究，而这些都是鉴定肿瘤干细胞必需的工作。但是，我们的研究应该能说明一点:即横纹肌样脑膜瘤如果存在肿瘤干细胞，很可能这些干细胞就属于表型为CD44+CD59+CD105+CD11a－CD31－Cd34－的细胞群中。

染色体分析获得的数据，符合既往在脑膜瘤中发现的染色体异常。良性脑膜瘤常见22号染色体异常，非良性脑膜瘤染色体异常则更广泛，尚涉及1号，11号等许多染色体。我们所做的核型分析还有一个意义，说明我们的细胞株不是来源于肿瘤中所夹杂的正常间质性支持组织，因为正常的间质支持组织不可能具有如此广泛的染色体异常。

总之，本研究从横纹肌样分离了具有较清晰的表面抗原特征，具有较强致瘤性一个细胞群。对于恶性脑膜瘤的发病机制的研究，提供了一个新的的体外模型。

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The establishment of human rhabdoid meningioma cell line.

HU Dezhi，WANGXiaomei，MAO Ying，ZHOU Liangfu.Department of Neurosurgery，Huashan Hospital，No.12 Wulumuqizhong Road，Shanghai200040，China.Tel:021 －52889999.

ObjectiveHuman rhabdoid meningioma(RM)is a rare but intractable tumor.To establish amodel for in vitro research，we attempt to establish a cell line from a RM sample.M ethods A combination of plastic adherence method，tumor sphere propagation were employed to establish the cell line.The cell surfacemarker profile，the cell proliferative activity，and the tumorigenic ability of this cell line were examined using flow cytometry analysis，XTT assay，and in vivo experiments respectively.Results The established cell line displayed a CD44+CD59+CD105+CD11a－CD31－CD34－phenotypewhich was similar tomesenchymal progenitors.The cell line has been passed formore than 50 generations so far.In vivo experiments showed that the RM cell line could successfully establish exnograft tumors in nudemicewhen injected at great than 1×105cells intra-cranially.The xenograft tumors exhibited histological features identical to the human original tumor.Conclusions We have successfully established a rhabdoid meningioma cell line with mesenchymal traits and tumorigenic ability from human brain.

Rhabdoid meningioma Cell line Mesenchymal cells

R651

A

* 上海复旦大学附属华山医院神经外科(上海 200040)

E-mail:yingmao168@hotmail.com)

2011－03－03)

(责任编辑:甘章平)

·综 述·