GoldeneyeTMDNA ID System 20A试剂盒确证实验

2011-01-30周密韦帆唐涛张韩秋王成权

皖南医学院学报 2011年3期

周密，韦帆，唐涛，张韩秋，王成权

(芜湖市公安局刑警支队，安徽芜湖241000)

GoldeneyeTMDNA ID System 20A是基点认知技术(北京)有限公司研发的荧光STR复合扩增试剂盒，它可以同时检测19个STR基因座(D19S433、D5S818、D21S11、D18S51、D6S1043、D3S1358、D13S317、D7S820、D16S539、CSF1PO、Penta D、vWA、D8S1179、TPOX、Penta E、TH01、D12S391、D2S1338、FGA)和一个性别位点Amelogenin。为了测试GoldeneyeTMDNA ID System 20A试剂盒的技术性能指标，评估其法医学应用能力，本实验室依据我国DNA检验的实际情况和要求，同时参照美国DNA分析方法专家组(TWGDAM)制定的确证指南[1]，从方法学验证、灵敏度测试、混合样本测试、批量样本测试、DNA提取方法适应性测试、各类常见检材的测试、稳定性测试等7个方面制定了对GoldeneyeTMDNA ID System 20A试剂盒的测试方案[2～6]，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂9700型PCR扩增仪(ABI公司，USA);3130XL遗传分析仪(ABI公司，USA);GoldeneyeTMDNA ID System 20A(基点认知技术公司，北京)。

1.2 实验操作除方法学验证外，其他实验均参照试剂盒提供的使用说明书进行。

1.3 方法学验证

1.3.1 热启动酶用量分别以0.5、1、2 U用量的热启动酶对125 pg的9947A标准品进行检验并重复一次。

1.3.2 退火温度分别设置退火温度为56、58、60、62、64℃，对125 pg的9947A标准品进行检验并重复一次。

1.3.3 扩增体系分别采用5、10、25 μl的扩增体系，对125 pg的9947A标准品进行检验并重复一次。

1.3.4 扩增循环次数分别设置热循环次数为26、28、30、32、34，对125 pg的9947A标准品进行检验并重复一次。

1.3.5 引物量分别以0.5×、1×、2×引物量对125 pg的9947A标准品进行检验并重复一次。

1.4 灵敏度测试取9947A标准品，分别以500 pg、250 pg、125 pg、62.5 pg、31.25 pg的模板量进行检验并重复一次。

1.5 混合样本测试取9947A和007标准品，分别定量后按19∶1、9∶1、5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、1∶9、1∶19的比例混合，依次编为1～9号，各取1ng进行检验。

1.6 批量样本测试对100个打拐建库样本进行扩增检测，并重复扩增检测一次。检验过程中采用自动化工作站提取、自动加样。

1.7 DNA提取方法适应性测试分别对样本采用Chelex-100、磁珠法、硅珠法、直接扩增法等方法进行扩增检验。

1.8 各类检材的测试提取血痕、精斑、唾液斑(烟蒂)、肌肉或肋软骨或骨骼DNA(每类8份、共32份检材)进行扩增检验。

1.9 试剂稳定性测试将GoldeneyeTMDNA ID System 20A试剂盒中的5×20A引物混合物、Allelic Ladder和内标进行反复冻融，在冻融5、10、15、20次后进行检测。

2 结果

2.1 方法学验证结果

2.1.1 热启动酶用量当热启动酶用量分别为0.5、1、2 U时，125 pg的9947A扩增均得到分型一致的结果，未出现等位基因丢失的情况，峰值在800～5 000 RFU之间，空白对照样本正常，未观察到非特异峰，部分基因座出现的Stutter峰均在主峰的10%以下，见图1。

2.1.2 退火温度分别以退火温度56℃、58℃、60℃、62℃、64℃进行扩增，均得到分型一致的结果，未出现等位基因丢失的情况，峰值在500～4 000 RFU之间，空白对照样本正常，未观察到非特异峰，部分基因座出现的Stutter峰均在主峰的10%以下，见图2。

2.1.3 扩增体系不同扩增体系进行扩增，均得到分型一致的结果，未出现等位基因丢失的情况，空白对照样本正常，未观察到非特异峰，部分基因座出现的Stutter峰均在主峰的10%以下。5 μl扩增体系峰值在100～2 000 RFU之间，10 μl扩增体系峰值在800～5 000 RFU之间，25 μl扩增体系峰值在200～1 500 RFU之间，见图3。

2.1.4 扩增循环次数随着扩增循环次数增加，扩增信号有增强的趋势。当使用26、28次循环时，部分基因座扩增不完全。30次循环扩增峰值在200～2 000之间，32次循环扩增峰值在1 000～8 000之间，34次循环扩增峰值在2 000～10 000之间。34次扩增信号过强出现渗透峰。空白对照样本正常。30、32、34次循环扩增均得到分型一致的结果，未出现等位基因丢失的情况。部分基因座出现的Stutter峰均在主峰的10%以下，见图4。

2.1.5 引物量当引物量分别为0.5×、1×、2×时均得到分型一致的结果，未出现等位基因丢失的现象。空白对照样本正常，未观察到非特异峰，部分基因座出现的Stutter峰均在主峰的10%以下。0.5×引物用量时峰值在100～2 000 RFU之间，1×引物用量时峰值在100～2 000 RFU之间，2×引物用量时峰值在100～2 000 RFU之间，见图5。

2.2 灵敏度测试分别使用500 pg、250 pg、125 pg、62.5 pg、31.25 pg的模板量的9947A标准品，以及30循环和32循环进行平行检验，得位点检测成功率，见图6。由图6可得，30循环和32循环下，62.5 pg组和31.25 pg组均未得到完整电泳图谱，该试剂盒的检测灵敏度均为125 pg。

2.3 混合样本测试GoldeneyeTMDNA ID System 20A检验9947A，007两者在混合分型中呈现的均衡度、递减、递增趋势与其在混合样本中的比例基本相符，见图7。混合比例在5∶1和1∶5之间时，超过90%的次要位点可成功检测到;当混合比例在9∶1和1∶9之间时，超过80%的次要位点可成功检测到;当混合比例达到19∶1和1∶19时，大约有58%的次要位点可检测到。

2.4 批量样本测试100个建库样本在各次检测中均获得完整清晰的图谱和稳定的分型结果。通过对100个建库样本进行统计分析，GoldeneyeTMDNA ID System 20A试剂盒的stutter峰高在各个基因座均在主峰的10%以下，见图8。

2.5 DNA提取方法和各类检材适应性测试Chelex-100、磁珠法、硅珠法、直接扩增法等4种方法提取10份血痕样本和10份口腔拭子样本扩增后检测，均获得完整的分型结果，未检见等位基因丢失现象。直接扩增法检测血痕和口腔拭子检验结果见图9。对各类案件常见检材如血痕、烟蒂、唾液斑、肋软骨等样本均获得完整图谱。

2.6 稳定性测试经过连续反复5、10、15、20次冻融检验结果之间没有明显变化。GoldeneyeTMDNA ID System 20A连续反复冻融20次的检验结果，见图10。

3 讨论

本文检测结果显示，GoldeneyeTMDNA ID System 20A试剂盒对常见案件检材具有很好的检测能力，对不同DNA提取方法有很好的适应性，具有较高的检测灵敏度(125 pg)，且大批量样本稳定性高，抗冻融性能好。该试剂盒在所测试的各项性能指标已经达到了国际同类产品的技术水平，可用于法庭科学的检案与建库。

GoldeneyeTMDNA ID System 20A试剂盒同时检测19个STR基因座和1个性别基因座，包含Amp-FlSTR®Identifiler(ABI Corporation)、AmpFlSTR®Sinofiler(ABI Corporation)、Power Plex®16 HS(Promega Corporation)3个试剂盒的所有基因座[7～9]，相当于3种试剂盒联合应用，具有较高的个体识别率和非父排除率。在DNA实验室日常应用中，“19+1”试剂盒通常足够DNA实验室绝大部分亲缘鉴定的需要。因此该试剂盒特别适合亲缘鉴定案件和被拐卖或失踪儿童的数据库建设。

GoldeneyeTMDNA ID System 20A试剂盒可应用直接扩增法。与PowerPlex®16 HS系统直接扩增[10，11]相比，该试剂盒在血样、口腔拭子、烟蒂等最常见生物检材中也可取得类似的有效分型结果，可适用于大批量样本的数据库建设。此外，结合该试剂盒在两个体混合样本不同混合比例的实验性应用与各基因座stutter峰高平均百分比，对比profile plus试剂盒(ABI Corporation)的混合样本分型[12，13]，该试剂盒在混合样本中次要位点检测成功率高，可较好地用于混合样本等疑难检材的分型。

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