高效液相色谱柱后衍生荧光测定伏格列波糖胶囊含量

张建中 李旭洲

（扬子江药业集团，江苏 泰州 225321）

伏格列波糖是一种双糖酶抑制剂，在肠道内可抑制将双糖分解为单糖的双糖水解酶，延迟糖类在小肠的消化和吸收，改善餐后高血糖，同时不伴有内源性胰岛素分泌的增加。伏格列波糖最早由日本武田制药公司（Takeda）开发，1999年在我国上市，且价格昂贵。为了造福更多的糖尿病患者，扬子江药业集团研制了伏格列波糖胶囊（0.2mg），满足临床用药需求。据文献报道，目前伏格列波糖含量测定有HPLC-ELSD[1]、RID-HPLC[2]等方法。本文根据公司实际情况，采用HPLC柱后衍生荧光[3]测定伏格列波糖胶囊含量，取得了较为满意的结果。

1 仪器与试药

Waters 510高效液相色谱仪；Waters 474荧光检测器；HW色谱工作站。

伏格列波糖对照品（上海三维制药有限公司提供，按干燥品计算，含C10H21NO799.8%）；伏格列波糖胶囊（扬子江药业集团）；磷酸盐缓冲液（pH3.5）：取磷酸二氢钠二水合物3.12g，加水1000mL使溶解，用磷酸调节pH至（3.5±0.1）即得；0.12%辛烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液（pH3.5）：取辛烷磺酸钠1.2g，加磷酸盐缓冲液（pH3.5）1000mL使溶解，即得；荧光试剂溶液：取牛磺酸6.25g与高碘酸2.56g，加水1000mL使溶解，即得。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Cosmosil C18柱（5μm，250mm×4.6mm i.d.），柱温35℃，理论塔板数按伏格列波糖计算应不低于4500。

流动相：甲醇-0.12%辛烷磺酸钠的磷酸盐缓冲液（pH3.5）（10∶90）。

流速：调节流动相流速，使伏格列波糖峰保留时间约为14min，距主成分保留时间前4.5min以内出现的峰均为杂质峰。

荧光检测器，激发光波长为350nm，发射光波长为430nm，柱后衍生化；反应浴温度约100℃，聚四氟乙烯反应管长20m（内径0.5mm）；冷却浴温度约15℃，聚四氟乙烯反应管长2m（内径0.3mm）；荧光试剂溶液的流速与流动相的流速相同。

2.2 空白辅料干扰试验

按照处方比例制备空白辅料胶囊，并配制成空白辅料溶液，进样200μL，结果无干扰。见图1。

2.3 系统适用性试验

图1 空白辅料及伏格列波糖对照品HPLC图

按照选定色谱条件，进对照液200μL，按n=5.54（tR/Wh/2）2，以伏格列波糖峰计算理论塔板数为5590，拖尾因子为1.03。连续进样5针，伏格列波糖峰面积RSD=0.61%，均符合规定。

2.4 线性范围与标准曲线

精密称取伏格列波糖对照品约20mg，置100mL容量瓶中，加水溶解，稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液3.5mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、6.5mL，置50mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。分别进样200μL，以浓度C（μg/mL）为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，结果回归方程为：A=1.332×104+1.329×104C，r=0.99999。结果表明，伏格列波糖在13.94～25.90μg/mL范围内呈良好线性。见表1。

表1 线性范围与标准曲线

2.5 溶液稳定性考察

取伏格列波糖胶囊适量，除去胶囊壳，将内容物混合均匀，研细，精密称取适量（约相当于伏格列波糖2.0mg），置100mL量瓶中，加水适量，超声使伏格列波糖溶解，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。将供试品溶液于室温放置0，2，6，12h，进行测定。结果表明本品溶液12h内稳定。见表2。

表2 样品溶液稳定性试验结果表

2.6 回收率试验

取对照品适量按照处方比例及工艺制备不同含量的伏格列波糖胶囊，其含量分别约相当于标示量的70%，100%，130%。用制备的上述伏格列波糖胶囊进行加样回收试验，结果伏格列波糖回收率为99.85%，RSD=0.41%。见表3。

2.7 重复性试验

取伏格列波糖胶囊适量，除去胶囊壳，将内容物混合均匀，研细，精密称取适量（约相当于伏格列波糖2.0mg），置100mL量瓶中，加水适量，超声使伏格列波糖溶解，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。照含量测定方法测定6次，结果表明本方法重复性较好。见表4。

2.8 中间精密度试验

照含量测定方法由不同操作者不同时间测定同一批样品的含量，结果表明本方法中间精密度良好。见表5。

表3 回收率试验结果表

表4 重复性试验结果表

表5 中间精密度试验结果

2.9 样品含量测定

取本品20粒的内容物，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于伏格列波糖2mg），置100mL容量瓶中，加水适量，超声使伏格列波糖溶解，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；领取伏格列波糖对照品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1mL中约含20μg伏格列波糖的溶液，作为对照品溶液。精密量取上述两种溶液各200μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，按照外标法以峰面积计算，即得。

对三个批次的样品含量进行测定，结果含量均在90.0%～110.0%，见表6。

表6 含量测定结果表

3 讨 论

3.1 用本法测定伏格列波糖胶囊含量，快速简便，精密度高，结果准确，重复性试验及回收率试验RSD均小于0.5%。

3.2 空白辅料干扰试验表明，伏格列波糖胶囊所用辅料对含量测定无影响。

3.3 溶液稳定性考察结果显示本品溶液在12h内稳定，确保了测定结果的可靠性。

3.4 因本品规格为0.2mg，测定溶液浓度小，所以进样量较大，达200μL；液相色谱仪每次的取样量为100μL，取样体积较大，在同一个取样瓶中抽两次之后，瓶中易形成负压，导致再抽样时取样量不准，故需在每次抽样后将瓶盖打开，然后再抽样，以保证进样的准确性。

[1]曾洁.RID-HPLC法测定伏格列波糖口腔崩解片中伏格列波糖含量[J].中国药事,2008,22(12)：1093-1094.

[2]王欣荣,孙敏,何璧梅,等.HPLC-ELSD测定法在伏格列波糖生产中的运用[J].中国抗生素杂志,2009,34(12)：730-733.

[3]徐瑾,张庆合,张维冰,等.液相色谱荧光衍生法在糖类物质分析中的应用[J].色谱,2003,21(2)：115-120.