HPLC测定益气升降汤中葛根素的含量

杨建明 曹 亮 郑月霞

（1 河北北方学院基础医学院，河北 张家口 075000；2 河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000；3 河北北方学院医学院药学专业2004级，河北 张家口 075000）

益气升降汤主要由葛根、黄芪、五味子等中药组成，具有扩张冠状动脉及脑血管作用，冠状动脉血流明显增加，降低心肌收缩功能，改善微循环作用。临床上主要用于冠状动脉粥样硬化性心脏病、心绞痛治疗，对缺血性脑血管疾病也有较好的疗效。葛根为益气升降汤的主要有效成分之一，其主要化学成分为异黄酮类化合物，葛根素为其代表性化合物，是药典中葛根药材和有关制剂的主要检测指标。益气升降汤现行质量标准仅有性状的描述及检查项，尚无鉴别项及含量测定的内容，根据中药药性的配伍原则，主要为葛根，为更好地控制其内在质量，现对处方进行定性鉴别，应用高效液相色谱法测定主药葛根的有效成分葛根素的含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

SSI高效液相色谱仪（美国）；KQ-500B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Sartorius BP2IID型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；WFH-203B型三用紫外分析仪（上海精科实业有限公司）；SZ-97A自动三重纯水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；薄层层析硅胶板GF254型（青岛海洋化工厂）；葛根素对照品（中国药品生物制品检定所提供，含量测定用）；益气升降汤及阴性对照（自制）；甲醇为色谱纯，水为三重蒸馏水（药理实验室自制），其他试剂均为分析纯。

1.2 处方与制备

1.2.1 处方

陈皮10g、半夏10g、茯苓10g、甘草6g、枳实12g、竹茹12g、党参30g、麦冬10g、五味子10g、桔梗10g、黄芪30g、葛根30g。

1.2.2 制备方法

按处方量精密称取各组分，粉碎均匀后进行中药有效成分提取：水煎煮全药，待沸腾后再煮30min，倾出第一煎液，静置后倾出滤液，向原药中倒入适量水同法继续煎煮，倾出第二煎液，静置后倾出滤液。合并两次滤液按1g/mL进行浓缩。阴性对照按上述方法不加葛根进行提取浓缩即可。

1.3 定性鉴别

1.3.1 对照品、供试品、阴性对照品溶液的制备

取葛根素对照品溶液加甲醇制成1mg/mL，作为对照品溶液（Ⅰ）；取本品5mL置小烧杯中，水浴浓缩成稠膏状，加甲醇15mL，超声处理30min，过滤，取滤液作为供试品溶液（Ⅰ）；取缺葛根素的阴性样品，按供试品溶液制备法制得阴性对照液（Ⅰ）。

1.3.2 薄层鉴别

照薄层色谱法试验吸取上述溶液各4μL分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以氯仿-甲醇-水（42∶15∶1.5）为展开剂，展开，展距14cm，取出，晾干，置紫外灯365nm下检视。

1.4 含量测定

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-水（25∶75）；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温：25℃；进样量：20μL。

1.4.2 对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液的制备

精密称取葛根素对照品5mg，置25mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀得200μg/mL葛根素对照品溶液（Ⅱ）。精密量取供试品溶液（Ⅰ）0.5mL，置10mL容量瓶中，加甲醇置刻度，摇匀即得供试品溶液（Ⅱ）。阴性对照品溶液（Ⅱ）的制备方法操作同上。

1.4.3 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液（Ⅱ）各1、2、2.5、3.5、5mL，置5个5mL容量瓶中，加甲醇溶液至刻度，摇匀。吸取上述5份对照品溶液适量，按色谱条件分别依次进样20μL，测定。

1.4.4 精密度考察

取对照品溶液（140μg/mL），重复进样5次，每次20μL，测定峰面积。

1.4.5 重复性试验

精密称取同一批样品3份，按本文方法提取制备供试品溶液分别注入液相色谱仪依法测定。

1.4.6 稳定性考察

取供试品溶液（Ⅱ）分别在0、2、4、8、12、24h后进样，每次20μL，依次测定峰面积。

1.4.7 回收率试验

精密量取同一批号益气升降汤3份，每份0.5mL，分别加入葛根素对照品溶液适量，按本文方法制备供试品溶液，进样20μL，按上述色谱条件测定峰面积，计算回收率。

1.4.8 样品含量的测定

取益气升降汤3批，分别制备供试品溶液，按上述色谱条件进行分析，根据外标法进行计算葛根素的含量。

2 结 果

2.1 定性鉴别

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的天蓝色斑点，阴性对照液无此斑点，说明供试品中含有葛根素，见图1。

图1 益气升降汤的薄层色谱图

2.2 含量测定

2.2.1 色谱系统性考察

所有组分均在55min内洗脱出柱，基线平稳。

2.2.2 线性关系考察

以峰面积为纵坐标，葛根素的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=38515X+27722，r=0.9992。结果表明，葛根素质量浓度在40～200μg/mL与峰面积有良好的线性关系。

2.2.3 精密度试验

葛根素的峰面积RSD=0.77%，表明精密度良好。

2.2.4 重复性试验

益气升降汤中葛根素含量平均值为3.35mg/mL，RSD为3.6%。

2.2.5 稳定性试验

葛根素峰面积的RSD为0.84%，结果表明供试品溶液在24h内基本稳定。

2.2.6 回收率试验

葛根素的平均回收率为98.93%，RSD为2.7%。

2.2.7 样品含量的测定

3批益气升降汤中葛根素的平均含量为3.36 mg/mL。

3 讨论与结论

3.1 提取方法的选择

葛根及葛根制剂中葛根素的提取方法有回流提取法和超声提取法[2-4]，同时文献报道葛根素提取方法都为超声提取，从操作的简便性和提取的完全性考虑，我们采用了超声提取方法。

3.2 检测波长的选择

参考有关文献[5-9]，本实验选用了250nm，254nm检测波长，发现在254nm波长处检测灵敏度高，分离度好，所以选用254nm为检测波长。

3.3 实验过程中的其他发现

薄层时在展缸内贴一块和内壁大小差不多的滤纸，可以解决因展开剂过于饱和而导致展开时间过长的问题。方法学研究结果表明，采用薄层色谱法对处方中的葛根进行定性鉴别，用高效液相色谱法对处方葛根中葛根素进行含量测定，操作简单，结果准确，重复性好，能够有效的控制产品质量。

3.4 结论

本方法能达到有效分离各组分的目的，且空白实验证明在葛根素色谱峰处其他成分无干扰，具有分离效果好、灵敏、准确、简便快速等优点，可作为益气升降汤的含量测定质量控制标准。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005：233-234.

[2] 康延国.中成药薄层色谱鉴别[M].北京：人民卫生出版社,1995：330-331.

[3] 杜迎翔,苗云明,邹志红.葛根汤的薄层色谱鉴别法研究[J].化工时刊,1998,12(5)：27-30.

[4] 李发美.医药高效液相色谱技术[M].北京：人民卫生出版社,1999：539-540.

[5] 张新春,蔡大伟,刘晋华,等.心脑通口服液的质量标准[J].中国药师,2005,8(3)：225-227.

[6] 刘正坤,谭生建,刘刚,等.高效液相色谱法测定感冒解热冲剂中葛根素的含量[J].中国中药杂志,1997,22(11)：735-736.

[7] 濮存海,张晓骞.HPLC测定小儿感冒舒颗粒中葛根素的含量[J].中成药,2001,26(8)：附6-附7.

[8] 钱频非.清热降糖颗粒中葛根素的含量测定[J].时珍国医国药,2006,17(11)：2258-2259.

[9] 黄亚非,张永明,何翱,等.采用高效液相色谱法测定心脉通口服液中葛根素的含量[J].中国中药杂志,2001,26(11)：760-761.