多形性胶质母细胞瘤放射前后ATM蛋白的表达及ATM/PI3-K区突变检测

陶胜忠 尹先印 牛光明 张鹏远

郑州大学第二附属医院神经外科 郑州 450014

多形性胶质母细胞瘤放射前后ATM蛋白的表达及ATM/PI3-K区突变检测

陶胜忠 尹先印 牛光明 张鹏远

郑州大学第二附属医院神经外科 郑州 450014

目的探讨多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞辐射前后ATM蛋白表达量的变化及ATM/PI3-K区基因突变的情况。方法采用流式细胞仪技术检测U251细胞系及5例原代培养的多形性胶质母细胞瘤细胞以2 Gy射线剂量照射前后ATM蛋白表达量的变化,以逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术和PCR产物直接测序方法,对多形性胶质母细胞瘤细胞中ATM/PI3-K区关键区域进行突变检测。结果U 251细胞系中60Co照射前后ATM蛋白量均明显低于原代培养GBM的ATM蛋白量,U 251和原代GBM细胞ATM蛋白表达量有显著差异(P＜0.05);U 251细胞系及原代培养GBM细胞60Co照射后的ATM表达虽有所升高,但经统计学分析无显著性差异(P＞0.05)。所测U 251细胞系及5例原代培养的多形性胶质母细胞瘤细胞中ATM/PI3-K区序列中未检测到基因突变。结论ATM蛋白表达水平不能完全反映ATM蛋白激酶的活性,多形性胶质母细胞瘤的放射抗拒可能与ATM/PI3-K区基因突变不相关。

多形性胶质母细胞瘤;A TM蛋白;A TM/PI3-K

多形性胶质母细胞瘤(gliob lastomamu ltiforme,GBM)是脑胶质瘤中恶性程度极高的一类肿瘤,手术难以全切,术后易复发且对放射治疗不敏感,预后不良。GBM对放射抗拒的机制尚不清楚。研究表明[1-2],ATM(ataxia telangiectasiamutated,ATM)基因是对电离辐射高度敏感的共济失调毛细血管扩张症的唯一致病基因,其 PI3-K(phosphatidylinositol-3-kinase)功能区的突变会引起细胞放射敏感性的改变。为探讨GBM对放射治疗抗拒的原因,我们采用流式细胞仪技术检测了U 251细胞系和5例原发GBM60Co照射前后ATM蛋白量的变化,并采用RT-PCR和PCR产物直接测序方法,对其ATM/PI3-K关键区域进行了突变检测。

1 材料与方法

1.1 研究对象及主要仪器 多形性胶质母细胞瘤细胞系U 251由武汉大学典型物保藏中心提供。5例原发多形性胶质母细胞瘤均经常规病理学检查证实。

1.2 细胞培养及照射 U251细胞系及5例GBM采用RPM I-1640培养基,pH值7.4,含10%小牛血清,青链霉素各100 IU/m L,处于指数生长的贴壁细胞用0.25%的胰蛋白酶消化后传代,细胞密度为1×106/m L接种于培养瓶中,置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中孵育过夜,用60Co治疗机以2Gy放射剂量进行照射,并于照射后4 h、24 h收取细胞。照射前后细胞以75%冰乙醇固定,至于-80℃冰箱待用。

1.3 流式细胞仪检测60Co照射前后ATM蛋白表达量ATM鼠抗人单克隆抗体购自晶美生物有限公司,FITC标记山羊抗小鼠IgG及Triton、BSA等试剂购自武汉凌飞科技有限公司。应用FACSort流式细胞仪进行检测,以488 nm激光激发,应用Mod LTFit 2.0软件进行ATM蛋白表达含量的分析。设立用PBS代替一抗的阴性对照及正常对照。

1.4 半定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)及产物序列分析 根据Genbank Database中ATM基因mRNA序列,应用PRIMER 5.0设计软件设计一对针对A TM主要功能区PI3-K区的引物。引物序列为：上游引物5'-CAGTGCCTTTCAGTGCCAAA-3',下游引物 5'-GTTTCATCTTCCGGCCTCTG-3',扩增产物为546 bp,内参照为β-action。引物及内参均由上海博亚生物技术公司合成。PCR产物序列分析由上海博亚生物技术公司完成。

2 结果

2.160Co照射前后ATM 蛋白表达量 U 251细胞系中60Co照射前后ATM 蛋白量均明显低于原代培养GBM的ATM 蛋白量(P＜0.05)。U251细胞系及原代培养GBM细胞60Co照射后的ATM 蛋白表达水平虽有所升高,但经统计学分析无显著性差异(P＞0.05)。

表1 U 251细胞系和原代培养GBM放射前后的ATM平均蛋白荧光强度

2.2 ATM mRNA表达量 紫外分光光度仪测定mRNA纯度：A 260/280∶1.8～2,提取的 mRNA经 RT-PCR后出现特异性的DNA条带。U251和原代GBM细胞ATM半定量RT-PCR产物电泳结果：其ATM m RNA相对表达量分别为0.327±0.047和0.758±0.091,经统计学分析,U251和原代GBM细胞ATM m RNA表达量有显著差异(P＜0.05)。

2.3 DNA序列分析 PCR产物经正反序列分析,结果与基因库中ATM序列完全一致。

3 讨论

ATM蛋白是辐射反应金字塔的中枢成分之一,可以早期感知辐射所致损害和启动检测点信号的功能,激活的ATM蛋白触发其下游通路并调节包括细胞周期阻滞、DNA修复和转录调节等特异的生化和细胞反应。ATM蛋白激酶是ATM蛋白的活性形式,该激酶与DNA辐射损伤后修复紧密关联,其活性改变引起DNA修复进程的中断可能是导致放射高敏感性的重要原因[3]。一旦暴露于离子射线,ATM蛋白激酶活性可被立刻激活,并导致许多涉及DNA修复、凋亡及细胞周期阻滞的关键靶基因的磷酸化作用[4]。

为此,我们采用流式细胞技术分别检测了来源于胶质母细胞瘤的U 251细胞系和5例原发多形性胶质母细胞瘤60Co照射前后ATM蛋白量的变化以期了解辐射对ATM蛋白表达水平的影响。结果发现,U 251细胞系中60Co照射前后ATM蛋白量均明显低于原代培养GBM的ATM蛋白量,多形性胶质母细胞瘤细胞在遭受2 Gy放射剂量照射后,ATM蛋白表达水平虽有所升高,但与照射前相比差异无统计学意义(P＜0.05)。文献报道,遭受辐射后ATM表达水平并未改变,但激酶活性却可增加数倍[3]。对正常人淋巴细胞进行细胞周期各时相特异的ATM激活 TP53-15丝氨酸磷酸化的研究显示,ATM蛋白激酶活性在细胞受电离辐射后立即上升,但和ATM蛋白量变化并不一致[15]。因而,我们认为ATM蛋白表达水平并不能完全反映其激酶活性,目前尚不清楚ATM如何被激活,可能与辐射后ATM的磷酸化及构象改变修饰染色质结构有关。

已建系的胶质瘤细胞在生物学特性上与体内的肿瘤细胞有较大差异,原代培养的细胞则不同,由于细胞刚刚离体,生物学特性未发生很大变化,仍具有肿瘤细胞的遗传物性,很接近体内的生长特性,即使组织类型、部位相同,个体差别也可以在培养的细胞上反映出来[4]。我们的结果显示了U 251细胞系和原代培养多形性胶质母细胞瘤ATM蛋白表达水平的差异(P＜0.05)。

到目前为止,已经发现了上百种ATM基因的突变类型,这些突变分布于ATM基因全长序列中,其中绝大多数突变表现为整个ATM基因的截短或大片断缺失,从而导致其表达产物失活[6]。PI3-K片断是ATM基因mRNA编码ATM蛋白关键活性区域的序列,抑制该区域蛋白翻译可以灭活ATM的功能。在放射等细胞DNA损伤条件下,ATM的PI3-K可作为细胞的生存因子降低细胞对放射线及类射线细胞毒药物的敏感性[7]。我们结合文献选择了作为ATM基因mRNA编码ATM蛋白PI3-K区关键区域序列(8578～9123 nt,546 bp)为靶点,应用反转录聚合酶链式反应方法获得ATM/PI3-K区域编码序列的cDNA片段,并对PCR产物进行直接测序。结果表明,在 U 251细胞株和原代培养的GBM细胞中,均未发现ATM/PI3-K区域的序列性突变。但由于ATM基因编码序列有12 kb,其中PI3-K区全长为1.2 kb[8],本实验仅检测了ATM基因m RNA编码ATM蛋白PI3-K区关键区域546 bp,因此不能排除ATM其他区域发生突变而影响其放射敏感性的可能性;另一方面,细胞的放射敏感性的改变涉及多种分子生物学过程[21-22],所以ATM基因突变以外的因素也可影响其放射敏感性。

[1]Yao KC,Komata T,Kondo Y,et al.Molecular response of hum an glioblastoma multiforme cells to ionizing radiation：cell cyc le arrest,modulation of the expression of cy clin-dependent kinase inhibitors,and autophagy[J].J Neu rosurg,2003,98(2)：378-384.

[2]陶胜忠,牛光明,尹先印,等.不同放射敏感性胶质瘤中 ATM蛋白、NF-κB表达及相关性研究[J].中国实用神经疾病杂志,2008,11(8)：7-9.

[3]Pandita TK.ATM function and telomere stability[J].Oncogene,2002,21(4)：611-618.

[4]Khanna KK,Jackson SP.DNA double strand b reaks：signaling,repair and the cancer connection[J].Nat Genet,2001,27(3)：247-254.

[5]Canm an CE,Lim DS,Cimprich KA,et al.Activation of the ATM kinase by ionizing radiation and phosphorylation of p53[J].Science,1998,281(5383)：1 677-1 679.

[6]Pandita TK,Lieberm an HB,Lim DS,et al.Ionizing radiation activates the ATM kinase th roughout the cell cycle[J].Oncogene,2000,19：1 389-1 391.

[7]Bradshaw PS,Condie A,M atutes E,et al.Break points in the ataxia telangiectasiagene arise at the RGYW somatichy permutation motif[J].Oncogene,2002,21(3)：483-487.

[8]任军,何伟,彭程,等.ATM基因与细胞放射敏感性[J].中华放射肿瘤学杂志,2003,12(2)：139-141.

ATM protein levelbefore and after radiation and genemutation of ATM/P-I3K region in glioblastomam ulti-form e cell

Tao Shengzhong,Yin X ianyin,N iu Guangm ing,eta l.Departmentof Neurosurgery,the Second A f f iliated Hosp italof Zhengzhou University,Zhengzhou450014,China

ObjectiveG lioblastomamu ltiforme(GBM)is one of themalignanciesmost resistant to radiation therapy.The aims ofour study w ere as follow s：firstly,quantify ATM protein level in GBM before and after radiation;second ly,detection of ATM genemutation to define the correlation betw een g liob lastoma multiforme cell radiosensitivity and gene mutation in the ATM/PI3-K coding region.M ethods ATM p rotein level in U 251 cell line and 5 cases primary cu ltureof GBM beforeand after radiation w ere determ ined by Flow cytometry;RT-PCR was used to get a 546bp fragmentof ATM cDNA form U251 cell line and p rimary culture of GBM,containing the phosphatidy linositol-3-kinase(PI3-K).Direct sequencing of RT-PCR p roductw as app lied to determ ine themutations in the gene.Resu lts In the U251 cell line and 5 cases primary cu lture of GBM,the authors demonstrated a transient increase in theexpression of A TM protein level after radiation,ATM protein can be up-regulated in response to radiation,but w ith no statistic difference(P＞0.05);U 251 cell line exp ressed ATM p rotein and ATM m RNA at considerably lower levels than primary tumors(P＜0.05).The sequenceof the 546bp fragment was identical to thoseof ATM gene published in gene bank.No genemutation was detected in the ATM/PI3-K region of GBM.ConclusionThe activity of ATM p rotein kinase is not associated with the expression levels of ATM p rotein.It indicates that there are no correlations betw een themutation of ATM/PI3-K and the radiosensitivity in GBM.The radiosensitivity of GBM may depend on some other factors and w ithout being related to ATM/PI3-K mutations.

GBM;A taxia telangiectasiamutated protein;ATM/PI3-K

R730.264

A

1673-5110(2011)09-0001-03

河南省青年骨干教师项目资助

book=3,ebook=190

(收稿2011-04-03)