去乙酰毛花苷注射液的杂质研究

2011-01-29李舸远陈东亚蔡美明陈民辉

药学与临床研究 2011年6期

李舸远，陈东亚，蔡美明，陈民辉，王玉

江苏省食品药品检验所，南京 210008

去乙酰毛花苷（Deslanoside）是由毛花洋地黄叶中提取的毛花洋地黄苷丙，经去乙酰化得到的化合物，又名去乙酰西地兰、去乙酰毛花洋地黄苷丙。该原料药制成的注射液主要用于治疗心力衰竭。由于其作用较快，适用于急性心功能不全或慢性心功能不全急性加重的患者[1-2]。随着该注射液的广泛使用，其不良反应的报道也逐渐增多。该注射液常见的不良反应有心律失常[3]、胃纳不佳或恶心、呕吐（刺激延髓中枢）、下腹痛，异常的无力、软弱，其中心律失常最为重要，为此，有必要对该注射液的安全性进行研究。然而，目前对该注射液的有关物质研究报道较少，在各国药典中，对该品种有关物质的规定都限量较宽且不够具体[4－5]。本文主要对去乙酰毛花苷注射液的杂质进行研究，为进一步监测去乙酰毛花苷注射液的不良反应，对其安全性进行再评价，以及提高去乙酰毛花苷注射液的质量标准提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1100 series LC/MSD Trap高效液相色谱离子阱质谱联用仪；Bruker AV-500型核磁共振仪；Thermo Nicolet 6700型傅立叶变换红外分光光度计；岛津UV-3600型紫外分光光度计；YM-3型熔点仪；旋转蒸发仪；电热手提高压蒸汽消毒器。

1.2 试药与试剂

去乙酰毛花苷注射液及同批原料（国内某药业有限公司，注射液批号：100401，规格0.2 mg·mL-1，原料批号：091201）；去乙酰毛花苷对照品（中国药品生物制品检定所）；地高辛苷元对照品（USP）；甲醇、乙腈为色谱纯；水为超纯水；氯仿、乙醇、甘油均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

原料、杂质A、去乙酰毛花苷对照品、地高辛苷元对照品分别用甲醇配制成约0.2 mg·mL-1。

辅料溶液：按处方量取甘油50g、95%乙醇100 mL，加水至1000 mL，摇匀。

酸破坏：取去乙酰毛花苷原料两份，各加1 mol· L-1盐酸5 mL，放置2 h，用1 mol·L-1氢氧化钠溶液调节pH至中性。

碱破坏：取去乙酰毛花苷原料两份，各加1 mol· L-1氢氧化钠溶液5 mL，放置2 h，用1 mol·L-1盐酸溶液调节pH至中性。

氧化破坏：取去乙酰毛花苷原料加30%双氧水2 mL，放置4 h。

光照破坏：取去乙酰毛花苷原料在3000Lx光照条件下分别放置5d、10d。

上述破坏均用辅料溶液配制成约0.2 mg·mL-1。

高温破坏：取去乙酰毛花苷原料，用辅料溶液配制成约0.2 mg·mL-1，分别于121℃高压灭菌20、40、60、120、240、720 min。

2.2 色谱与质谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX－SB C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：乙腈-甲醇（232∶148）；流动相B：水；流速：1.0 mL·min-1；梯度洗脱：0～20 min流动相A 38%、20～22 min流动相A由38%升至52%、45～47 min流动相A又降至38%继续平衡5min；检测波长：220nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

电喷雾离子源（ESI），源电压4.5 kV，毛细管温度：270℃，毛细管电压20V，载气流速70 mL·min-1，正负离子检测，扫描方式：全扫描一级质谱，相对碰撞能量100%，质量数范围100～2000。进样方式：分流进样，分流比为1∶4。

2.3 专属性试验

取“2.1”项下各溶液，分别按“2.2”项下色谱条件进行试验，考察色谱条件专属性及样品杂质情况。结果酸、碱、氧化、光照及高温破坏供试品溶液中的各杂质均能良好分离，辅料对杂质检测无干扰。去乙酰毛花苷注射液中以归一化法测含量大于0.1%的主要杂质有7个，分别依次命名为杂质A、B、C、D、E、F、G，其中最大的杂质为杂质A。结果表明，去乙酰毛花苷在高温、酸、光照的条件下均可产生杂质A，以高温条件下产生的较多。见图1～4。

图1 供试品溶液中主要杂质典型色谱图

图2 去乙酰毛花苷原料破坏试验汇总图

图3 去乙酰毛花苷原料破坏试验汇总图从上至下依次为原液、光照破坏5天、10天

图4 去乙酰毛花苷原料破坏试验汇总图从上至下依次为原液、高温破坏20、40、60、120、240、720 min

2.4 杂质A的制备、分离与纯化

取去乙酰毛花苷原料3 g，用辅料溶液配制成约0.2 mg·mL-1，121℃ 120 min后，注入预先制备好的大孔树脂（Amberlite XAD-6）柱中进行吸附，先以水、20%乙醇水溶液各洗脱一个柱体积，再以100%乙醇洗脱，收集100%乙醇洗脱液，旋转蒸发浓缩，得到固体A。再进行硅胶柱层析，以氯仿-甲醇（10∶1.2）为洗脱液洗脱，收集杂质A的浓集部分洗脱液，旋转蒸发浓缩，得杂质A的粗品，反复进行硅胶柱层析，得到杂质A的精制品，再经甲醇重结晶，装于西林瓶中，置盛有五氧化二磷的减压干燥器中，40℃减压干燥24 h，即得。

2.5 杂质A的紫外光谱解析

取杂质A与去乙酰毛花苷对照品用甲醇配制成约10 μg·mL-1，在200～400 nm波长范围扫描测定UV光谱图。杂质A与去乙酰毛花苷的紫外光谱图完全一致，最大吸收波长均为220 nm。去乙酰毛花苷分子结构中具有C=C和C=O的共轭结构，其中C=O是强吸收，吸收系数ε＞104。杂质A与去乙酰毛花苷均符合甲型强心苷元的吸收特征，以此推断：杂质A与去乙酰毛花苷具有相同的苷元母核共轭结构。

2.6 杂质A的红外光谱解析

取杂质A、地高辛苷元对照品与KBr粉末混匀、研细、压片，在4000～400 cm-1波数范围测定。结果杂质A与地高辛苷元对照品的红外光谱一致。

2.7 主要杂质的质谱解析

取注射液和“2.1”项下的杂质A溶液、去乙酰毛花苷对照品溶液、地高辛苷元对照品溶液，分别按“2.2”项下色谱与质谱条件进行试验，结果杂质A溶液与注射液中杂质A及地高辛苷元对照品溶液的一级质谱显示出相同的m/z 413.5、m/z 803.5、m/z 389.5，推测分别为 [M+Na]+峰、[2M+Na]+峰、[M-H]+峰，可以推测杂质A的分子量为390.5，分子式为C23H34O5，初步确定为地高辛苷元。杂质C的一级质谱显示出m/z 521.6、m/z 519.6，推测分别为[M+H]+峰、[M-H]+峰，推测杂质C分子量为520.6，分子式为C29H44O8，初步确定为Digoxigenin Monodigitoxoside。杂质 E的一级质谱显示出 m/z 651.7、m/z 649.7，推测分别为[M+H]+峰、[M-H]+峰，推测杂质E分子量为650.7，分子式为C35H54O11，初步确定为Digoxigenin Bisdigitoxoside。

2.8 杂质A的核磁共振及综合解析

取杂质A以CD3OD溶解并绘制1H-NMR、13CNMR。杂质A：白色粉末，熔点210℃，熔融同时分解。Legal反应显阳性，喷以10%硫酸乙醇试剂显橙色，提示该化合物可能为甲型强心苷类化合物。1HNMR结果显示：δ 5.90（1H，s）和δ 4.92（2H，dd）两个质子信号分别为五元不饱和内酯环上22位及21位H信号，δ 0.97（3H，s）和δ 0.79（3H，s）分别为18、19位甲基氢信号。13C-NMR化学位移结果与文献[6]报道的Digoxigenin的13C-NMR数据一致，故鉴定该化合物为地高辛苷元，Digoxigenin，化学名：3β，12β，14-三羟基-5β-强心甾-20（22）-烯内酯。

3 讨论

3.1 本次实验的色谱条件，对2010版《中国药典》收载的去乙酰毛花苷有关物质检查项下色谱条件进行了优化，通过对梯度的调整，使得色谱图的基线更加平稳，有利于杂质F的检测。

3.2 曾经按“2.2”项下色谱与质谱条件同时对去乙酰毛花苷注射液及其生产时使用的对应批号原料进行有关物质分析测定，结果原料中未检出杂质A，可见注射液中杂质A产生主要来源于制剂工艺。

3.3 由破坏性试验结果显示，去乙酰毛花苷原料在酸破坏、光照破坏条件下降解产生杂质A、C、E（见图1、2），在121℃高温破坏下也同样均可产生杂质A、C、E，其中杂质C、E的量在120 min时达到最大，720 min时几乎完全转化为杂质A。根据上述破坏试验以及对杂质A的质谱分析结果，推测降解产生杂质A的可能途径如下：去乙酰毛花苷在酸、光照、高温等条件下，三处洋地黄毒糖基的氧苷键发生断裂产生杂质A（杂质C、E的制备、分离及结构鉴定由另文发表），其可能的降解途径见图5。

3.4 按“2.2”项下色谱条件在200～400 nm波长范围内对杂质A进行扫描检测，结果显示其纯度为99.9%。曾测得杂质A熔点为210℃，熔融时同时分解，与地高辛苷元对照品（来源：USP）说明书提供的熔点（210℃）相同。

3.5 取杂质A、去乙酰毛花苷原料用甲醇配制成0.1 mg·mL-1的溶液，在200～400 nm波长范围进行扫描，结果杂质A、去乙酰毛花苷原料均在220 nm波长处有最大吸收，且紫外光谱图完全一致。去乙酰毛花苷分子结构中具有紫外吸收的化学键为苷元结构中的C=C和C=O的共轭结构，其中C=O是强吸收，吸收系数ε＞104，根据紫外光谱图判断杂质A与去乙酰毛花苷具有相同的苷元母核共轭结构。