登革2型病毒与整合素β3相互作用机制的研究

明 颖，高 娜，张俊磊，陈 辉，王 娟，范东瀛，吴江漫，安 静

登革病毒（dengue virus,DV）为黄病毒科单股正链RNA 病毒，仅含有一个开放读码框，编码3 个结构蛋白（C,prM 和E）以及7 个非结构蛋白（NS1～NS5）。依E 蛋白抗原性的不同，DV 分为4 个血清型（DV1～4），以埃及伊蚊和白纹伊蚊为传播媒介，引起人类的登革热（dengue fever,DF）、登革出血热/登革休克综合征（dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome,DHF/DSS），后者症状较重，有明显的出血倾向，病死率高，但发病机制尚不明确，目前多数学者认为可能与血管内皮细胞（vascular endothelial cell,VEC）功能改变或者结构改变有关[1-2]。

整合素是广泛分布于细胞表面的跨膜糖蛋白受体，由α 和β 亚单位组成。作为信号受体，不仅介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用，并在细胞的生长、移行、增殖和分化等诸多生理过程中亦发挥重要作用。已知VEC 表面分布着丰富的整合素β1 和β3。有研究发现，整合素β3 对维持毛细血管的完整性、调节血管通透性方面具有重要作用[3-4]。在前期研究中，我们发现DV2 进入哺乳动物株ECV304 细胞需要整合素β3 分子的参与[5-6]。但有研究表明，依据细胞类型的不同，介导DV 吸附和进入宿主细胞的蛋白分子有所不同[7-9]。本实验旨在探讨DV2 感染VEC 株EA.hy926过程中，整合素β3 的可能作用及其与之相互作用的病毒蛋白，在观察DV2 感染后整合素β3 表达变化的基础上，进一步将表达DV2 各个蛋白的质粒转染EA.hy926 细胞，分析病毒蛋白与整合素β3表达及共存关系，期望为深入阐明DV 致病机制提供有价值参考资料。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株和病毒株 EA.hy926、C6/36 和Vero细胞由本教研室保存。DV2（Tr1751 株）分离自登革热患者，由日本感染病研究所大谷明博士惠赠。病毒经C6/36 细胞增殖，-80 ℃冻存备用。Vero 细胞噬斑法检测病毒滴度。

1.1.2 抗体 DV2 兔多克隆抗体为本实验室自制，鼠抗人整合素β3 单克隆抗体购自英国abcam 公司，异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）标记的羊抗兔IgG 及Cy3 标记的羊抗鼠IgG 购自美国Sigma 公司。

1.1.3 质粒 DV2 各病毒蛋白质粒pRe-C、pRe-E、pRe-NS1-2a、pRe-NS2b、pRe-NS3、pRe-NS5 及空载体pReceiverM01 由本实验室构建和保存，pNS4a-HA、pNS4-HA 由Adolfo García-Sastre[10]惠赠，HCV C 蛋白质粒pHCV-C 由本室构建和保存。

1.2 实验方法

1.2.1 增殖曲线测定 将EA.hy926 细胞制成细胞悬液，传代于六孔培养板，2×105/孔，37 ℃，5%CO2，孵育18～24 h 后，吸出培养上清液，磷酸缓冲液（phosphate buffer solution,PBS）润洗1 次，进而加入DV2［感染复数（multiplicity of infection,MOI）=1］感染，分别于感染后1、2、3、4、5、6 d 各取出200 μl 培养上清液，采用Vero 细胞噬斑法检测病毒滴度，绘制增殖曲线。实验重复3 次。

1.2.2 病毒感染实验 将EA.hy926 细胞制成细胞悬液，以2×105/孔接种于内置玻片的六孔培养板中，37 ℃，5% CO2，孵育18～24 h 后，吸出培养上清液，用PBS 润洗1 次，进而加入DV2（MOI=1）。模拟感染组（mock 组）则加入56 ℃灭活30 min 的DV2 液，同等条件置于37 ℃，5%CO2孵育，于24、48、72 h 将细胞爬片取出进行免疫荧光双染色。

1.2.3 病毒蛋白转染EA.hy926 细胞 抽提质粒pRe-C、pRe-E、pRe-NS1、pRe-NS2b、pRe-NS3、pRe-NS5、pNS4a-HA、pNS4b-HA DNA，分别转染EA.hy926细胞，同时设pHCV-C、pReceiverM01 空质粒转染EA.hy926 细胞作为对照。操作步骤参照Lipofectin Reagent 脂质体转染说明书，转染后48 h，免疫荧光方法检测整合素β3 的表达量变化及其与各蛋白的共存情况。

1.2.4 免疫荧光双染色 将病毒感染或转染后得到的细胞爬片以4%多聚甲醛固定20 min，0.2%Triron X-100 通透5 min，进而用含1%的牛血清白蛋白PBS 进行封闭20 min，加兔抗DV2 抗体（1∶100稀释），4 ℃孵育过夜，PBS 洗3 次（5 min/次），加入羊抗兔IgG-FITC（1∶300 稀释），室温孵育1 h 后，PBS洗3 次（5 min/次），加入鼠抗人整合素β3 单克隆抗体（1∶100 稀释），4 ℃孵育过夜，用PBS 洗3 次（5 min/次），加入羊抗鼠IgG-Cy3（1∶300 稀释），室温孵育1 h后，PBS 洗3 次（5 min/次），以荧光显微镜（Olympus BX61）及激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP5）观察β3 表达量的变化及与病毒蛋白的共存情况。

2 结 果

2.1 增殖曲线测定 DV2 感染EA.hy926 细胞后于不同的时相点收获培养上清液，采用Vero 细胞进行滴度测定，结果见图1：在该细胞株中，DV2 最高滴度在感染后第5 天出现，滴度达到1.7×105pfu/ml，说明DV2 能够在EA.hy926 细胞中进行增殖，可以将该细胞株作为实验对象用于后续试验。

图1 DV2在EA.hy926细胞中的增殖曲线Figure1 Growth curve of DV2 in EA.hy926 cells

2.2 病毒感染实验 病毒感染后不同时相点采用间接免疫荧光检测整合素β3 表达量的变化（图2）。结果如图所示：与mock 组相比较，病毒感染后可见红色荧光染色较强的细胞，整合素β3 的表达明显增强，荧光主要分布于细胞膜，并且随着感染时间的延长，整合素的表达量增加，胞浆也可见特异性荧光。经免疫荧光双染色，激光共聚焦显微镜下观察病毒抗原和整合素β3 的共存，发现病毒感染后整合素β3 的表达量增高，且病毒抗原与整合素β3 有明显共存（图3～5），24 h 共存主要分布在包膜，48～72 h胞浆内也可见一定量的共存。

图3 DV2 感染24 h 后病毒抗原与整合素β3 共存(Bar=10 μm)Figure3 Co-localization of virus antigen and β3 integrin after 24 hours of DV2 infection (Bar=10 μm)

图4 DV2感染48 h后病毒抗原与整合素β3共存(Bar=10 μm)Figure4 Co-localization of virus antigen and β3 integrin after 48 hours of DV2 infection (Bar=10 μm)

图5 DV2感染72 h后病毒抗原与整合素β3共存(Bar=10 μm)Figure5 Co-localization of virus antigen and β3 integrin after 72 hours of DV2 infection (Bar=10 μm)

2.3 转染实验结果 将pRe-C、pRe-E、pRe-NS1-NS2a、pRe-NS2b、pRe-NS3、pRe-NS5、pNS4a-HA、pNS4b-HA、pHCV-C、pReceiverM01 分 别 转 染 至EA.hy926 细胞后，间接免疫荧光检测病毒蛋白与整合素β3 表达情况见图6～7。结果显示转染后48 h，pRe-E 蛋白的表达可诱导整合素β3 的表达，且E蛋白与整合素β3 的表达存在明显共存。除E 蛋白外，其他9 种DV2 蛋白质粒和pHCV-C 及空质粒的转染对整合素β3 表达无明显影响，也未见其与整合素β3 有明显共存。

图6 空载体质粒转染48 h 免疫荧光染色结果(Bar=10 μm)Figure6 EA.hy926 cells were double-stained for empty vector plasmid and β3 integrin after 48 hours of trans-fection (Bar=10 μm)

3 讨 论

图7 pRe-E 蛋白质粒转染后免疫荧光染色结果(Bar=10 μm)Figure7 EA.hy926 cells were double-stained for pRe-E and β3 integrin(Bar=10 μm)

DV 感染已成为热带和亚热带地区一个严重的公共卫生问题，全世界每年有5 千万～1 亿人感染DV，特别是以与我国接壤的东南亚地区最为严重[11]。目前对DV 感染尚无有效的疫苗和治疗措施。DHF/DSS 的主要病理生理特点是血浆渗漏，而病理学检查未发现VEC 有明显器质性损害，提示VEC 功能障碍导致血管通透性增加可能是DHF/DSS 发生的主要原因。

VEC 表面整合素含量丰富，多种病毒受体研究结果提示，整合素分子可以作为病毒受体或共受体[12-13]，协助病毒进入宿主细胞，在病毒与宿主细胞相互作用的过程中发挥重要作用[13-14]。而DV 感染VEC 的受体目前尚不明确[15]，因此本研究选用血管VEC 株EA.hy926 细胞作为研究对象，探讨整合素在病毒进入VEC 的过程中所发挥的作用。

前期的实验中，我们研究了整合素β3 在DV2感染中的作用，提示整合素β3 有助于DV2 进入宿主细胞[5-6]。本实验首先证明了EA.hy926 能够支持DV的复制，增殖曲线显示，最高滴度出现在感染后第5 天，且光镜下感染组与对照组细胞形态无明显差别，因此EA.hy926 可以作为研究DV感染机制的细胞模型。进一步实验发现，DV 感染可使EA.hy926 细胞中整合素β3 的表达量增高，且随感染时间的延长有渐增趋势。在此基础上，我们将编码DV2 病毒蛋白的10 个质粒分别转染EA.hy926 细胞，观察不同病毒蛋白转染后整合素β3 表达量的变化。结果表明，转染E 蛋白可诱导整合素β3 的表达，E 蛋白与整合素β3 有明显的共存，而其他病毒蛋白的表达对整合素β3 表达无明显影响，也无明显共存。提示E 蛋白有可能作为DV感染细胞的吸附蛋白，与整合素β3 相互作用，介导DV2 的进入细胞。

整合素β3可以特异性识别配体的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）三肽序列，从而介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质之间的相互作用，发挥其粘附和信号转导两大基本功能。研究发现，口蹄疫病毒、柯萨奇病毒以及腺病毒都通过RGD 依赖的方式与整合素分子结合进入细胞，但是DV2 的相关区域不含有RGD 序列，表明DV2 与整合素的相互作用并不依赖RGD 序列[16]。近期的研究发现，DV E 蛋白Ⅲ区外侧的FG 环被认为是宿主细胞感染的关键分子，为哺乳动物细胞感染DV2所必需[17]。然而也有研究表明，E 蛋白Ⅲ区与哺乳动物细胞株的结合可能不依赖于FG 环[18]。因此，整合素β3 与E 蛋白是否通过上述位点结合，尚须进一步研究证实。

综上所述，本文从血管通透性增高的机制入手，研究DV 感染对VEC 功能的影响，将有助于阐明DHF/DSS 的成因，为DV 感染的防治提供理论依据。

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